鮑文華，王　瑾，李樹民，楊曉東，馬雪梅，孫云暉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154003)

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PU.1在肺纖維化大鼠中的作用①

鮑文華，王瑾，李樹民，楊曉東，馬雪梅，孫云暉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的:探討博來霉素所致肺纖維化大鼠中PU.1的表達(dá)水平，探究地塞米松對(duì)肺纖維化的作用機(jī)制。方法:將30只SPF級(jí)SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組(N)，模型組(B)，地塞米松治療組(D)，每組10只。每組大鼠分別在第28天處死。氣管內(nèi)注射博萊霉素制作肺纖維化模型。采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測肺泡灌洗液(BALF)PU.1mRNA的含量。結(jié)果:(1)模型組肺泡灌洗液PU.1mRNA含量明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)地塞米松治療組PU.1mRNA含量較模型組明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子PU.1在肺纖維化中起作用，地塞米松可能通過下調(diào)PU.1的表達(dá)抗肺纖維化。

關(guān)鍵詞：肺纖維化；轉(zhuǎn)錄因子；PU.1；地塞米松

肺纖維化是間質(zhì)性肺炎中最常見類型，預(yù)后較差。炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及其分泌的介質(zhì)和細(xì)胞因子，在引起肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病上起重要作用。富含嘌呤盒1(purine-rich box 1，PU.1)是E26(E-twenty six，ETS)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是造血干細(xì)胞增殖和分化的主要調(diào)節(jié)因子，維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，對(duì)機(jī)體炎癥及免疫起重要作用。本實(shí)驗(yàn)，我們觀察肺間質(zhì)纖維化大鼠PU.1的表達(dá)量，旨在探討轉(zhuǎn)錄因子PU.1在肺纖維化中的作用及地塞米松抑制肺纖維化的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

博萊霉素購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒由哈爾濱HaiGene公司提供。離心機(jī)為上海安亭公司產(chǎn)品、光學(xué)顯微鏡為奧林巴斯公司產(chǎn)品、PCR儀為Bio-Rad Min-Opticon2。

1.2方法

①模型建立：30只SPF級(jí)SD大鼠(佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，6~8周齡，體重200~230g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：健康對(duì)照組(N)、模型組(B)、地塞米松治療組(D)，BLM組處理方案參照文獻(xiàn)[1]并在此方案上改進(jìn)，采用氣管內(nèi)注入博萊霉素制作肺纖維化模型，地塞米松治療組在肺纖維化模型基礎(chǔ)上第8天將3mg/kg地塞米松腹腔注入，健康對(duì)照組用生理鹽水替代博萊霉素，持續(xù)到第28天后處死。

②BALF的收集：以10%水合氯醛極量腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位于鼠板上，切開胸部，暴露氣管和主支氣管，結(jié)扎右主支氣管，用14號(hào)針頭插入氣管中，結(jié)扎，經(jīng)氣管注入生理鹽水2mL，抽吸混勻，反復(fù)灌洗三次，共收集肺泡灌洗液4mL，1500r/min,離心15min，上清-80℃保存。

③肺組織標(biāo)本的留取：暴露氣管與雙肺，分離肺組織，用止血鉗夾閉右肺門并結(jié)扎，立即取下右肺，PBS沖洗肺臟表面，用濾紙拭干，將肺組織給予4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于HE染色。

④PU.1mRNA測定：離心處理BALF，留取沉淀，采用Trizol法抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測PU.1mRNA表達(dá)水平，引物序列為PU.1：5’- TGCTTCCCTTATCCACCCTTG-3’(上游)5’- TCTTCTTGCTGCCTGTCTCC-3’(下游)；GAPDH：5’-AACTCCCATTCTTCCACCTTT-3’(上游)5’-CTCTTGCTCTCAGTATCCTTG-3’(下游)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1肺組織形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡鏡下觀察N組肺組織結(jié)構(gòu)正常，無纖維化改變。B組與N比較肺組織出現(xiàn)明顯纖維化改變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增寬，纖維沉積明顯，肺組織呈廣泛纖維化改變。D組與B組比較肺組織纖維化程度明顯減輕，肺泡間隔增厚減輕。依據(jù)Szapiel方法進(jìn)行肺纖維化評(píng)分：0級(jí):無纖維化；I級(jí):病變范圍占全非20%以下；II級(jí):病變范圍占全肺的20%～50%；III級(jí):病變范圍超過全肺50%。與健康對(duì)照組比較，模型組和地塞米松治療組肺纖維化評(píng)分明顯增高；與肺纖維化組比較，地塞米松組肺纖維化評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1 。

表1　大鼠肺組織纖維化評(píng)分

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.05;與肺纖維化組比較，#P<0.05。

2.2大鼠肺泡灌洗液PU.1mRNA含量比較

采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測大鼠肺泡灌洗液PU.1mRNA表達(dá)量，健康對(duì)按照組、模型組、地塞米松治療組PU.1mRNA含量分別為0.901±0.137、1.051±0.126、0.886±0.171，與健康對(duì)照組比較，模型組PU.1mRNA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)地塞米松治療組較健康對(duì)照組無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，地塞米松治療組PU.1mRNA含量明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

肺纖維化(PF)系間質(zhì)性肺炎中的一種，病變局限于肺部，引起彌漫性肺纖維化，導(dǎo)致肺功能損害和呼吸困難等癥狀。PF無明確流行病學(xué)資料，近年來臨床診斷的病例有增加趨勢，且死亡率高，5年生存率為70%，中位生存期為3年或出現(xiàn)癥狀后5年，目前肺纖維化目前尚無有效治療手段，預(yù)后差[2]。肺纖維化病因及機(jī)制尚不甚明了，損傷的肺泡上皮細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤及其分泌的炎癥介質(zhì)促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化的形成。已有文獻(xiàn)表明，轉(zhuǎn)錄因子PU.1有助于造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞方向和淋巴細(xì)胞方向正常增殖和分化，促進(jìn)粒細(xì)胞炎癥趨化，同時(shí)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及受體[3]。所以，PU.1干預(yù)肺纖維化過程中多種細(xì)胞和因子的表達(dá)及作用。 目前肺纖維化亦無明顯有效治療手段，雖然推薦新藥吡非尼酮的應(yīng)用，但因廣泛不良反應(yīng)和價(jià)格昂貴，應(yīng)用受限[4]。糖皮質(zhì)激素作為抗肺纖維化藥物存在諸多爭議，根據(jù)最新指南，潑尼松、硫唑嘌呤、NAC三聯(lián)療法僅用于IPF患者[5]。

地塞米松作為糖皮質(zhì)激素，通常認(rèn)為其抗纖維化作用與抑制中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，抑制巨噬細(xì)胞增殖和分泌等有關(guān)[6,7]。

本研究結(jié)果表明，大鼠肺泡灌洗液中PU.1mRNA的表達(dá)含量模型組明顯高于健康對(duì)照組，表明PU.1可以促進(jìn)肺纖維化的形成。與模型組組比較，地塞米松組PU.1mRNA含量明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且大鼠肺纖維化經(jīng)過地塞米松治療后PU.1含量接近健康對(duì)照組，兩者無明顯差異，說明地塞米松起到一定抗纖維化作用。轉(zhuǎn)錄因子PU.1及地塞米松在肺纖維化中的作用均與炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞有關(guān)，故而猜想地塞米松可能通過抑制PU.1起到抗肺纖維化的作用。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療均尚不明確，本研究結(jié)果初步顯示轉(zhuǎn)錄因子PU.1在大鼠肺纖維化中起作用，地塞米松可能通過抑制PU.1的表達(dá)含量起到抗纖維化的作用。具體將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

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(收稿日期:2015-11-20)

中圖分類號(hào)：R563

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)01-0015-02

作者簡介：鮑文華(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

基金項(xiàng)目：1.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：H201370；2.佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：LM2015_033。