項(xiàng)龍慶，羅　渢　(中國人民解放軍9608部隊(duì)衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)所，上海 0009；上海第七人民醫(yī)院口腔科，上海 0037)

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片仔癀對部分肝切除小鼠的肝再生的作用研究

項(xiàng)龍慶1，羅渢2(1中國人民解放軍92608部隊(duì)衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)所，上海 200092；2上海第七人民醫(yī)院口腔科，上海 200137)

【摘要】目的：研究片仔癀對70%肝切除小鼠肝再生的影響，為臨床肝再生用藥研究提供動(dòng)物模型. 方法：將8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(片仔癀預(yù)處理組)和對照組(生理鹽水預(yù)處理組). 采用70%肝切除方法建立肝再生模型，術(shù)前連續(xù)兩周通過灌胃給予小鼠片仔癀0.2 mg/g體質(zhì)量(實(shí)驗(yàn)組)和生理鹽水(對照組). 第14天灌胃完片仔癀和生理鹽水2 h后對兩組小鼠分別進(jìn)行70%肝切除手術(shù)(PH). 用肝質(zhì)量/體質(zhì)量比、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real Time PCR)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和免疫組化等研究方法來評(píng)估片仔癀對小鼠部分肝切除手術(shù)后肝再生的影響. 結(jié)果：與對照組相比，70%肝切除手術(shù)后48、72、168 h，實(shí)驗(yàn)組肝質(zhì)量/體質(zhì)量比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后12、24、48、72 h，實(shí)驗(yàn)組血清ALT水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后12、24、48、72、168 h，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞生長因子(HGF)降低；術(shù)后48 h，實(shí)驗(yàn)組Ki-67表達(dá)量低于對照組. 結(jié)論：片仔癀對70%肝切除小鼠的肝再生產(chǎn)生抑制作用，延緩了肝再生過程.

【關(guān)鍵詞】片仔癀;小鼠;部分肝切除;肝再生

0引言

肝臟的再生能力很強(qiáng)，但在正常的肝臟中肝細(xì)胞處于分化成熟狀態(tài)，很少見到核分裂. 當(dāng)肝臟遭受手術(shù)切除、創(chuàng)傷、中毒、感染壞死以及肝移植術(shù)等致部分肝臟喪失后，低分化狀態(tài)發(fā)生改變，肝細(xì)胞快速增殖重新修復(fù)[1]. 因此研究肝再生的機(jī)制具有重要的臨床意義，促進(jìn)肝再生的藥物研發(fā)也備受關(guān)注. 部分肝切除是研究肝再生的經(jīng)典模型[2-3]. 片仔癀是蜚聲中外的名貴中成藥，由麝香、牛黃、蛇膽、三七等名貴中藥精制而成，它原是明代太醫(yī)的秘方，被廣泛用于治療急慢性肝炎、多種創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)，甚至癌癥[4]. 研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，片仔癀對四氯化碳造成的肝細(xì)胞壞死具有緩解作用，它還可抑制結(jié)腸癌小鼠模型的腫瘤血管生成. 目前尚無片仔癀對肝切除術(shù)后肝再生的研究報(bào)道，本研究旨在探討片仔癀對肝再生的作用，為進(jìn)一步開發(fā)片仔癀提供依據(jù).

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組將雄性8周齡的C57BL/6小鼠(體質(zhì)量20～25 g)(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(片仔癀預(yù)處理組)和對照組(生理鹽水預(yù)處理組)，實(shí)驗(yàn)組每天灌胃0.2 mg/g體質(zhì)量片仔癀懸液，對照組灌胃等量的生理鹽水，干預(yù)持續(xù)兩周. 第15天對兩組小鼠進(jìn)行肝切除手術(shù)，切除肝臟的70%.

1.2指標(biāo)測定

1.2.1小鼠肝質(zhì)量/體質(zhì)量比以上兩組小鼠于術(shù)后12、24、48、72、168 h分別麻醉后處死8只，進(jìn)行稱重，并且計(jì)算肝質(zhì)量/體質(zhì)量比. 將其中4只小鼠的部分肝組織立即置于4%多聚甲醛中固定；另外4只小鼠分別取肝組織凍存在液氮中.

1.2.2RNA提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time PCR)用反轉(zhuǎn)錄和Real Time PCR法來分析mRNA表達(dá)水平. 總RNA用TRIzol(購自美國Invitrogen Corp)法根據(jù)制造商的步驟來提取. 將RNA用反轉(zhuǎn)錄酶(購自Takara公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA. Real Time PCR體系包括cDNA，SYBR Green PCR混合液(購自Takara公司)及引物(購自鉑尚生物技術(shù)有限公司).

1.2.3Ki-67免疫組織化學(xué)檢測冰凍切片由-20℃冰箱取出后放室溫30 min，用0.01 M的檸檬酸鈉緩沖液微波煮沸修復(fù)抗原15 min. 室溫冷卻，滴加封閉用正常羊血清工作液室溫孵育30 min. 甩掉后滴加Ki-67抗體(美國Epitomics公司產(chǎn)品)，1∶100，室溫，1～2 h，PBS洗滌. 滴加熒光兔二抗Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG(美國ThermoFisher公司產(chǎn)品)工作液，1∶250，室溫，1～2 h，PBS洗滌. 滴加DAPI染色液，37 ℃，5 min. PBS洗滌3次，5 min/次. 封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察.

1.2.4血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性檢測血液樣本4 ℃靜置過夜，4℃，9000 rpm，離心10 min，分離血清. 血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性用上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性測量試劑盒測量，詳細(xì)方法與產(chǎn)品說明書一致.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1片仔癀干預(yù)對肝臟質(zhì)量的影響肝臟受到損傷之后就立即開始了再生過程，在70%肝切除模型中，術(shù)后24h肝臟殘余部分代償性增生至原肝質(zhì)量的45%，72h達(dá)到70%，7～14d達(dá)到93%，20d左右恢復(fù)原肝質(zhì)量[7]. 實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的肝臟均有不同程度的增生，增生肝臟的形狀不規(guī)則. 術(shù)后12、24h兩組小鼠肝臟的質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05). 術(shù)后48h開始，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟的質(zhì)量的增加較少；術(shù)后72、120、168h，小鼠肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)比值顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟再生能力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，小鼠肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)比值顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟再生能力下降. 術(shù)后168h，對照組小鼠的肝臟質(zhì)量基本恢復(fù)到術(shù)前水平，而實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟質(zhì)量仍顯著低于正常水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1).

表1兩組小鼠肝臟質(zhì)量(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)變化

(n=48，x±s,%)

aP<0.05vs對照組；bP<0.01vs對照組.

2.2血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平變化情況丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)大部分存在于肝細(xì)胞的胞漿中，當(dāng)肝細(xì)胞受損，細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，肝細(xì)胞中的ALT就會(huì)釋放到血液中，引起血清ALT的活性上升. 因此，ALT被當(dāng)做檢測肝臟損傷的重要生物學(xué)標(biāo)志. 部分肝切除對肝臟造成的損傷導(dǎo)致兩組小鼠血清中的ALT活性都顯著上升，術(shù)后12 h、24 h、48 h和72 h，實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清ALT活性均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組小鼠的血清ALT活性在術(shù)后72 h恢復(fù)至術(shù)前水平，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在術(shù)后72 h仍維持在較高水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2).

表2兩組小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶變化情況

(n=30，x±s，U/L)

aP<0.05vs對照組；bP<0.01vs對照組.

2.3Ki-67在肝臟中的表達(dá)Ki-67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在細(xì)胞增殖的各期(G1，S，G2和M)中均有表達(dá)，但在細(xì)胞靜止期G0期不表達(dá)[8]. 肝組織中Ki-67陽性反應(yīng)產(chǎn)物為紅色熒光顆粒，在肝細(xì)胞核中表達(dá). 在小鼠肝臟切除術(shù)后24 h可見Ki-67少量表達(dá)，48 h肝臟表達(dá)Ki-67最為活躍，72 h未見明顯表達(dá). 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后24、48、72 h肝臟Ki-67表達(dá)量均低于對照組(圖1).

圖1　部分肝切除48 h后肝組織Ki-67表達(dá)

2.4組織HGFmRNA相對表達(dá)量肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是存在于急性肝損傷動(dòng)物血漿中的蛋白因子，可以刺激細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，在血管生成、腫瘤發(fā)生和組織再生的過程中發(fā)揮著重要的作用[9]. 從術(shù)后12 h開始，實(shí)驗(yàn)組小鼠的HGF mRNA表達(dá)量低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2).

圖2　組織HGF mRNA相對表達(dá)量

3討論

肝臟具有很強(qiáng)的再生能力，經(jīng)手術(shù)切除部分肝組織后，殘余的肝組織細(xì)胞便會(huì)立即進(jìn)入快速增殖狀態(tài). 肝再生不是被切除的肝葉重新長出，而是殘余肝細(xì)胞的增生，肝細(xì)胞增殖的過程受控于臨近細(xì)胞釋放的多種信號(hào)分子，是一個(gè)多基因參與和多步驟協(xié)同的復(fù)雜過程[10].

本研究成功建立了小鼠的70%肝切除模型，以肝質(zhì)量/體質(zhì)量比、血清ALT水平、肝臟Ki-67表達(dá)水平、HGF mRNA水平作為標(biāo)志來判斷肝再生的強(qiáng)弱. 研究結(jié)果表明，片仔癀對于肝切除小鼠的肝再生過程會(huì)產(chǎn)生不利影響.

對于片仔癀的保肝作用，科學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)，片仔癀對四氯化碳造成的肝損傷具有保護(hù)作用，進(jìn)一步的肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明片仔癀可以激活重要信號(hào)通路的反應(yīng)元件. 而另一項(xiàng)研究[11]則表明取代片仔癀的一種重要成分麝香并不影響其對四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用. 對于片仔癀的抗癌作用，研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，其可顯著降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的存活率，并可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡. 片仔癀對癌細(xì)胞生長的抑制作用在一定程度上可以解釋其對肝再生過程產(chǎn)生的不利影響.

片仔癀作為蜚聲中外的名貴中成藥，其處方、工藝均屬國家絕密級(jí)秘密，客觀上不利于對該藥的進(jìn)一步研究. 此外，其復(fù)方制劑中的多種成分之間可能存在相互作用，即藥效的協(xié)同作用和拮抗作用，這也從一定程度上增加了對其有效成分和機(jī)制研究的難度. 片仔癀等中成藥的臨床應(yīng)用應(yīng)在經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生的指導(dǎo)和觀察下使用，不宜作為日常保健品自行服用.

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Effect study of Pien Tze Huang on liver regeneration after partial hepatectomy in mice

XIANGLong-Qing,LUOFeng

1Sanitary and Anti-epidemic Institute, 92608 Regiment of PLA,Shanghai 200092;2Department of Stomatology, Shanghai Seventh People’s Hospital, Shanghai 200137, China

【Abstract】AIM: To explore the influence of Pien Tze Huang on liver regeneration after 70% PH and provide an animal model for clinical investigation of drugs for liver regeneration． METHODS: The C57BL/6 mice were randomly divided into experimental group and control group. Mice in the control group were given 0.9% saline by intragastric administration, while the mice in the experimental group were given 0.2 mg/g body weight Pien Tze Huang for two weeks before 70% PH. A C57BL/6 mice model of liver regeneration were established by 70% hepatectomy. Mice were all subjected to 70% PH two hours later at day 14. The influence of Pien Tze Huang on liver regeneration were assessd by liver weight/body weight ratio, real-time PCR, ALT activity detection and immunochemical staining of Ki-67. RESULTS: At 48, 72 and 168 h after 70% PH, the liver weight/body weight ratio in the experimental group decreased when compared with the control group, with statistically significant difference(P<0.05); At 12, 24, 48, 72 h after PH, ALT levels in serum in the experimental group increased, and the difference was statistically significant(P<0.05); At 12, 24, 48, 72 and 168 h after PH, HGF level of experimental group was significantly lower than the control group, and the difference was statistically significant(P<0.05);At 48 h after PH, the Ki-67 expression of the experimental group was significantly less than the control group, and the difference was statistically significant(P<0.05). CONCLUSION: Pien Tze Huang can obviously inhibit liver regeneration on mice after 70% partial hepatectomy, which delays regeneration process of liver.

【Keywords】Pien Tze Huang;mice;partial hepatectomy;liver regeneration

【中圖分類號(hào)】R657.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

作者簡介：項(xiàng)龍慶. 本科，主治醫(yī)師. E-mail:kakka171@hotmail.com

收稿日期：2015-12-01；接受日期：2015-12-18

文章編號(hào)：2095-6894(2016)01-09-03

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·