張玉婷， 孟 元，郭慶勇,王振寶，吳 敏，張 楊，巴音查汗

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.浙江大學(xué)生科院，杭州 310058)

新疆革蜱源性綿羊無漿體病原DNA檢測(cè)

張玉婷1， 孟 元2，郭慶勇1,王振寶1，吳 敏2，張 楊1，巴音查汗1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.浙江大學(xué)生科院，杭州 310058)

【目的】探究新疆部分地區(qū)羊體表寄生的優(yōu)勢(shì)革蜱攜帶病原狀況?！痉椒ā坎捎眯螒B(tài)學(xué)(借助顯微鏡)和分子生物學(xué)(革蜱種屬特異性ITS-2F、ITS-2R引物進(jìn)行擴(kuò)增)方法，對(duì)采集于阿勒泰、巴音郭楞州等地州羊體表寄生的蜱蟲(N=267)進(jìn)行種屬鑒定，對(duì)其攜帶的綿羊無漿體病原(MSP4基因?yàn)榘袠?biāo)) DNA 進(jìn)行PCR檢測(cè)。【結(jié)果】當(dāng)?shù)匮蝮w表寄生的優(yōu)勢(shì)種革蜱為草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.slivarum)和邊緣革蜱(D.marginatus)，均能攜帶病原MSP4基因，且這三種革蜱種特異基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列(820 bp)與已登錄記載的同種革蜱的核苷酸同源性為99%。被革蜱叮咬的126份羊全血樣品中 34份為綿羊無漿體陽性，均能擴(kuò)增出850 bp目的基因條帶?！窘Y(jié)論】新疆阿勒泰地區(qū)、巴音郭楞州等地州羊群感染了綿羊無漿體病，其陽性率為27%(34/126)。為進(jìn)一步研究新疆革蜱的公害州及羊無漿體病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

革蜱；鑒定；綿羊無漿體；病原DNA；檢測(cè)

0 引言

【研究意義】蜱隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門，蛛形綱，蜱螨目，蜱亞目，是一類以吸取宿主血液為生的體表寄生蟲[1,2]。我國已記載的蜱種110種，分為硬蜱和軟蜱兩大類[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】硬蜱直接叮咬或攜帶病原體對(duì)宿主造成傷害，直接危害表現(xiàn)為被叮咬動(dòng)物騷動(dòng)不安和傷口感染而致生產(chǎn)性能下降，大量寄生時(shí)，分泌的毒素引起動(dòng)物麻痹, 造成蜱癱[4-5]；更重要的是它是許多病原體的傳播媒介和保蟲宿主[6]。其中以革蜱作為傳播媒介的疾病主要有：森林腦炎(Forest-spring Encephalitis)、萊姆病(lyme disease)、土拉菌病( Tularaemia)、北亞蜱媒斑點(diǎn)熱(Rickettsiosis sibirica)、Q熱(Q fever)及人畜共患無漿體病等，給人類健康和畜禽業(yè)造成嚴(yán)重危害[2]，已成為全球醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)學(xué)界倍加關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[7-8]。【本研究切入點(diǎn)】新疆幅員遼闊，羊養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，如阿勒泰和巴音郭楞州等地州的大部分羊群均自然放牧為主，容易被硬蜱侵襲導(dǎo)致蜱媒疾病?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究從自然放牧羊群中隨機(jī)采樣，了解當(dāng)?shù)匮蛏砩衔绲膬?yōu)勢(shì)種媒介蜱的同時(shí)，檢測(cè)其攜帶病原狀況，即革蜱源性綿羊無漿體病原的感染情況等，為新疆綿羊無漿體病及其媒介蜱的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、蜱、全血

阿勒泰和巴音郭楞州自然放牧羊群隨機(jī)采樣，其中采集于羊體表吸血的蜱蟲為267只，羊全血為126份。

蜱：采集于新疆阿勒泰地區(qū)綿羊無漿體流行區(qū)的羊體上未吸血活蜱、半飽血活蜱和飽血活蜱約1 654只(雌雄均有)，從中隨機(jī)抽取119只雄蜱，148只雌蜱作為檢測(cè)樣品(除去飽血和半飽血蜱蟲)，且保證從各地區(qū)最少抽到雌蜱和雄蜱各25只。全血：采集被革蜱叮咬的126份羊全血樣品，保存于-20°C,備用。

1.1.2 試劑及儀器

10% 的NaOH、乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)、1:1的無水乙醇丙二醇、100%丙二醇、中性樹膠、甲醇、蒸餾水；瓊脂糖、溴化乙錠；PCR permix；DNA Mark(康為)；基因組提取試劑盒(賽百盛)，質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA)，膠回收試劑盒(OMEGA)。

顯微鏡(Motic BA400)，組織解剖鏡(Motic SMZ-168)，培養(yǎng)箱，溫度和濕度表，氧化鋅膠袋，挑蟲針，玻璃管，HWS12型電熱恒溫水浴鍋；移液器，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，Gel Doc2 000紫外凝膠成像系統(tǒng)，DYCP-31DN型水平電泳槽，掃描電鏡(日立序520型)。

1.2 方 法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

2.4.3 浸出物檢測(cè) 采用熱浸法測(cè)定，直接粉碎得到的枸杞子粉末與經(jīng)上述3種預(yù)處理方法得到的枸杞子粉末，其浸出物量分別為75.4%、75.6%、72.6%、72.5%，均未少于55.0%。

1.2.1.1 蜱的玻片標(biāo)本制作與觀察對(duì)蜱蟲樣品進(jìn)行清洗處理，從外觀特征上初步分類，鏡下對(duì)其做進(jìn)一步鑒定。蜱在制片之前，需先用10%的NaOH或KOH水溶液煮沸數(shù)分鐘，直至蟲體內(nèi)部的肌肉和內(nèi)臟被溶解排出，蟲體軟化透明為止。然后經(jīng)清洗-脫水(依次經(jīng)過30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇)-透明(乙醇和1:1的無水乙醇丁香油、純丁香油各0.5～1 h)-封片(用光學(xué)樹脂膠或加拿大樹膠封片)后鏡檢。

1.2.1.2 光學(xué)顯微鏡觀察革蜱，形態(tài)學(xué)鑒定要點(diǎn)借助體視鏡觀察革蜱的盾板、假頭、假頭基形狀、口下板、生殖孔、肛溝、氣門板及足基節(jié)等形態(tài)特征，根據(jù)新疆蜱類志分類檢索表進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類鑒定[9]。

1.2.2 革蜱分子生物學(xué)鑒定

1.2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已建立的革蜱類鑒定的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，目的片段大小為820 bp。上游引物：ITS-2F:5'-TCGTCTGTCTGAGGGTCGGA-3'，下游引物:ITS-2R:5'-TCGTCTGTCTGAGGGTCGGA-3'，主要擴(kuò)增革蜱種屬特異性核酸。

參考de la Fuente等[10]合成檢測(cè)山羊無漿體MSP4基因的引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為850 bp，上游引物SF：5'-CCGGATCCTTAGCTGAACAGGAATCTTGC-3'；下游引物：5'-GGGAGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3'。所有引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2.2 革蜱DNA及羊全血DNA的提取將單個(gè)蜱蟲樣品置于大平皿中用蒸餾水刷洗干凈后，在研缽中研磨充分后，加入200 μL PBS(1×)緩沖液，20 μL Proteinase K消化液，混勻，與56℃恒溫水浴鍋消化30 min后，用DNA提取試劑盒進(jìn)行革蜱基因組DNA的提取；取綿羊血液300 μL用DNA提取試劑盒提取，DNA分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 革蜱DNA的PCR鑒定革蜱源性DNA擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix 10 μL，ITS-2F(10 μM)2 μL，ITS-2R(10 μM)2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 革蜱源性無漿體MSP4的PCR檢測(cè)羊無漿體反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix 10 μL，SF(10 μM)2μL，SR(10 μM)2 μL，模板DNA 2 μL(1.2.2.2中的綿羊全血DNA)，ddH2O 4 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蜱形態(tài)學(xué)鑒定

借助顯微鏡下形態(tài)，如盾板琺瑯斑、氣門板、假頭基、足基節(jié)、緣朵、眼等形態(tài)結(jié)合革蜱相關(guān)檢索表進(jìn)行革蜱種屬鑒定。研究表明，此次采集點(diǎn)羊體表寄生的優(yōu)勢(shì)種革蜱為草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.slivarum)和邊緣革蜱(D.marginatus)。

2.1.1 草原革蜱(Dermacentornuttalli)

盾板亞圓形，寬闊，其上琺瑯彩明顯。足轉(zhuǎn)節(jié)Ⅰ背距短，末端圓鈍。足基節(jié)Ⅳ外距不超過該節(jié)后側(cè)緣。氣門板背突較直而短，不達(dá)盾板邊緣，其背緣無幾丁質(zhì)增厚部。成蜱主要寄生在羊、牛、馬等大型家畜體表，有時(shí)也侵襲人。可傳播巴貝斯蟲和無漿體等。

2.1.2 森林革蜱(Dermacentorsilvarum)

盾板琺瑯彩明顯，足轉(zhuǎn)節(jié)I背距末端尖細(xì)。足基節(jié)Ⅳ外距明顯，末端超出該節(jié)后緣，氣門板逗點(diǎn)形，背突末端伸達(dá)盾板邊緣，背緣無幾丁質(zhì)增厚部。成蟲寄生在各種家畜和大型野生動(dòng)物體表，也侵襲人,可傳播巴貝斯蟲和無漿體等。

2.1.3 邊緣革蜱(Dermacentormarginatus)

盾板琺瑯彩較淡，足較粗壯。基節(jié)I外距明顯短于內(nèi)距?；?jié)II、III外距短小，呈齒狀, 氣門板大，長(zhǎng)逗點(diǎn)形，背突微彎，伸至盾板邊緣，末端寬窄有變異。成蟲寄生在羊、牛、馬等大型家畜體表，可傳播巴貝斯蟲和無漿體等。

2.2 革蜱分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 革蜱ITS-2序列PCR擴(kuò)增

以所提取的蜱蟲基因組DNA為模板，經(jīng)ITS-2F、ITS-2R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增出大小為820 bp的電泳條帶，與目的片段相符。圖 1

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～18：部分樣品的PCR產(chǎn)物；19：陰性對(duì)照

2.2.2 革蜱源性羊無漿體病原DNA檢測(cè)結(jié)果

以所提取的革蜱及羊血液基因組DNA為模板，經(jīng)SF、SR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增出大小為850 bp的電泳條帶，與目的片段相符。圖 2

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),1～10:1～10號(hào)樣品的PCR產(chǎn)物

2.2.3 革蜱及其攜帶羊無漿體病原基因克隆測(cè)序

2.2.3.1 革蜱種屬特異性基因克隆的測(cè)序

選取圖1前10個(gè)樣品中，PCR產(chǎn)物強(qiáng)陽性的條帶，擴(kuò)大PCR反應(yīng)體系至50 μL，做膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接至T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，得到預(yù)期大小的片段。測(cè)序結(jié)果表明，采集蜱蟲的ITS序列與NCBI中登錄的慶陽株(JQ737109.1)和平?jīng)鲋?JQ737108.1)同源性均為99%，判定出該蜱蟲為邊緣革蜱、草原革蜱及森林革蜱。

2.2.3.2 羊無漿體病原基因克隆的測(cè)序

同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所獲得的綿羊無漿體MSP4序列與綿羊無漿體甘肅株(HQ456347)同源性最高，達(dá)到100%，與其他綿羊無漿體同源性為99%，與邊緣無漿體的同源性為94%。由此可知，新疆阿勒泰地區(qū)部分羊感染的是綿羊無漿體，其感染率。表1

表1 所采集革蜱攜帶無漿體情況

Table.1 Faunal distribution of mediaDermacentorin Xinjiang

革蜱種革蜱數(shù)量革蜱對(duì)應(yīng)的綿羊全血份數(shù)綿羊無漿體MSP4陽性數(shù)量綿羊無漿體MSP4陽性率(%)草原革蜱100421433 3森林革蜱10042819 0邊緣革蜱67421228 6總計(jì)2671263427 0

3 討 論

試驗(yàn)將形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合鑒定羊體表吸血的革蜱類，發(fā)現(xiàn)羊體表寄生的革蜱優(yōu)勢(shì)種為草原革蜱、森林革蜱、邊緣革蜱。依據(jù)三種新疆革蜱類優(yōu)勢(shì)分布種的生物學(xué)特征[10-12]及其攜帶病原狀況，可建議在革蜱活動(dòng)季節(jié)新疆阿勒泰、巴州等地放牧區(qū)域羊群加強(qiáng)對(duì)革蜱侵襲羊群吸血而導(dǎo)致無漿體病。與孫明等[13]報(bào)道的甘肅景泰縣的羊無漿體的感染(30.6%)相比，新疆阿勒泰、巴州的部分羊感染有綿羊無漿體感染率(27%)相近，這說明新疆阿勒泰、巴州地區(qū)的部分羊感染了綿羊無漿體，需要加強(qiáng)對(duì)革蜱的生物防控。另外，被媒介革蜱叮咬的羊群全血內(nèi)存在綿羊無漿體，該情況與殷宏等[14]報(bào)道的一致。

4 結(jié) 論

研究為羊體表吸血革蜱種及其攜帶病原等的檢查提供了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)方法，同時(shí)為蜱媒疾病控制及蜱媒種群分析等研究工作提供了基礎(chǔ)。

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Fund project:Supported by Supporting Xinjiang by Science and Technology Program (2013911061)

The DNA Detection of Dermacentor-borneAnaplasmaovisin Xinjiang

ZHANG Yu-ting1, MENG Yuan2, GUO Qing-yong1, WANG Zhen-bao1,WU Min2, ZHANG Yang1, Bayinchahan1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China; 2.CollegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058)

【Objective】 To explore the situation of pathogen of Dermacentor on the surface of sheep from parts of Xinjiang. 【Method】 The dermacentor species of grazing flocks surface parasitic ticks acquisited from Altay, Korla and other places in Xinjiang were identified by using morphology (through microscopy) and molecular biology method (amplification of Dermacentor species-specific ITS -2F, ITS-2R primers). In addition, pathogen ofAnaplasmaovis(MSP4 gene as targets) was detected by PCR. 【Result】 The results showed that the advantages ofDermacentorfrom local sheep wereD.nuttalli,D.slivarumandD.marginatusand they all carriedAnaplasmaovis. The amplification product of specific gene primers from these Dermacentor was about 820 bp. Homology analysis indicated that the nucleotide of tested samples had 99% homology with that of the same species ofDermacentornucleotidelogged GenBank. Its nucleotide homology with that from GenBank was up to 99%. There are 34 positive samples which were amplificated by target gene primers (about 850 bp) in 126 whole blood samples, which suggested that sheep from Altay and Korla were infected with Amplasam ovis and the rate of infection was 27%.【Conclusion】 The test has provided scientific basis for further study of the disadvantages ofDermacentorin Xinjiang and for the prevention and control ofAmplasamovis.

Dermacentor; identification;Amplasamovis; DNA of pathogen; detection

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.025

2015-05-06

自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(2013911061)

張玉婷(1989-)，女，云南大理人，碩士研究生，研究方向?yàn)榧纳x分子免疫學(xué)，(E-mail)529652225@qq.com

巴音查汗(1964-)，女，新疆人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，(E-mail)bynch@hotmail.com

S852.74+6

A

1001-4330(2016)01-0185-05