李月榮，李榮飛，張 波,2，李迪迪，王曉琴

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832002；2.省部共建新疆特種資源植物藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002)

FeCl3溶液誘導(dǎo)葡萄愈傷組織白藜蘆醇積累及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系

李月榮1，李榮飛1，張 波1,2，李迪迪1，王曉琴1

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832002；2.省部共建新疆特種資源植物藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002)

【目的】研究葡萄白藜蘆醇的誘導(dǎo)劑，為開(kāi)發(fā)新的葡萄保鮮劑與農(nóng)藥提供參考?！痉椒ā坎捎肍eCl3水溶液對(duì)紅地球葡萄葉片愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，應(yīng)用HPLC分析愈傷組織中白藜蘆醇的含量變化，DAB染色法檢測(cè)活性氧水平，使用RT-PCR方法分析茋合酶基因(STS)的表達(dá)量變化。【結(jié)果】FeCl3溶液對(duì)葡萄愈傷組織茋類物質(zhì)具有顯著的誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)白藜蘆醇的積累呈現(xiàn)顯著的量時(shí)依賴性；1.6 mM FeCl3溶液處理18 h后愈傷組織中白藜蘆醇含量可提高約8.5倍，鮮重達(dá)到210.8 μg/g。FeCl3溶液處理組的活性氧水平均高于對(duì)照組；加抗氧化劑CAT和NAC可明顯降低FeCl3對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)效果?！窘Y(jié)論】FeCl3溶液對(duì)紅地球葡萄葉愈傷組織白藜蘆醇積累具有顯著升高作用，其積累機(jī)制與FeCl3所導(dǎo)致的氧脅迫正相關(guān)。

白藜蘆醇；FeCl3溶液；愈傷組織；氧化應(yīng)激

0 引 言

【研究意義】白藜蘆醇(Resveratrol，縮寫(xiě)Res)又稱茋三酚，存在于葡萄、虎杖、桑葚、花生等植物中，是一種植保素。葡萄葉片中白藜蘆醇含量較低，僅為0.06～46 μg/g鮮重，作為植保素，葡萄在真菌感染、干旱、鹽堿或其他氧化脅迫條件下白藜蘆醇含量會(huì)升高?？梢曰谝陨涎芯砍晒麑ふ乙环N有效、綠色、廉價(jià)的誘導(dǎo)劑用于葡萄植株的病害預(yù)防或葡萄的保存?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已有報(bào)道可以升高葡萄材料白藜蘆醇的非生物誘導(dǎo)劑有UV[1-3]、CO2[4]、臭氧[5]、H2O2[6]、乙磷鋁[7]、氯化鋁[8]、CuSO4[9]、茉莉酸甲酯[10]、水楊酸[11]等，同時(shí)也有研究報(bào)道表面活性劑SDS、TX-100可顯著增加H2O2的誘導(dǎo)作用[12]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葡萄葉片材料白藜蘆醇含量與其所處氧化脅迫狀態(tài)密切相關(guān)[2,13]，但葉片材料對(duì)液體誘導(dǎo)劑吸收相對(duì)局限，所用誘導(dǎo)劑如鋁劑毒性過(guò)大，限制了其在果實(shí)保藏上的應(yīng)用?，F(xiàn)有的植物營(yíng)養(yǎng)元素中，在滴水觀音的營(yíng)養(yǎng)液中加入過(guò)量的 FeCl3溶液之后，會(huì)對(duì)滴水觀音造成有效的氧化脅迫[14]。FeCl3又屬于低毒性的化學(xué)試劑，而葡萄愈傷組織所處環(huán)境易控制，底物含量低等，研究鐵劑對(duì)葡萄葉片愈傷組織的誘導(dǎo)更有意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究已表明FeCl3溶液可以對(duì)某些植物造成氧化脅迫，而對(duì)于葡萄來(lái)說(shuō)，氧化脅迫是一種有效升高其白藜蘆醇含量的方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以紅地球葡萄葉片愈傷組織為材料，研究FeCl3溶液是否會(huì)對(duì)葡萄愈傷造成氧化脅迫，從而使白藜蘆醇含量升高。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 紅地球葡萄

紅地球葡萄(VitisviniferaL. cv. Red Globe)由新疆石河子葡萄研究所提供，于石河子大學(xué)藥園培育(25℃)；選擇頂端的嫩葉作為外植體材料。

1.1.2 試劑

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，過(guò)氧化氫酶(Catalase，縮寫(xiě)CAT，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine，縮寫(xiě)NAC，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)； 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine,縮寫(xiě)DAB，北京索萊寶公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；其余試劑均為分析純，稀釋及空白處理中的水為實(shí)驗(yàn)室制備雙蒸水。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄外植體的處理及誘導(dǎo)

以紅地球葡萄頂端嫩葉作為外植體材料誘導(dǎo)愈傷組織。采用B5培養(yǎng)基附加1 mg/L 的2,4-D(2,4一二氯苯氧乙酸)，1 mg/L 的6-BA(6-芐基氨基嘌呤)，2%蔗糖和0.6%瓊脂，pH值在3.2～5.7，于121℃高壓滅菌30 min。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，無(wú)光照培養(yǎng)。每20 d繼代一次，取繼代三次后白色、蓬松、完整的愈傷組織作為實(shí)驗(yàn)材料，并用相機(jī)(Canon EOS 400D，日本)及顯微鏡(Zeiss Primo Star，德國(guó) )拍照。愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代均采用無(wú)菌操作。圖1

A：紅地球葡萄葉片;B：宏觀狀態(tài)；C:微觀狀態(tài)(400×)

A：the leaves ofVitisviniferaL.cv.Red Globe;B：macroscopic state；C： microstate(400×)

圖1 白色愈傷組織來(lái)源(紅地球葡萄葉片)

Fig. 1 The sources of white callus

1.2.2 FeCl3處理葡萄葉片愈傷組織

選用分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mM不同濃度的FeCl3溶液于10 mL離心管中浸泡處理愈傷組織，置于25 ℃恒溫箱中，暗孵育18 h；以及使用1.6 mM的FeCl3溶液分別暗孵育0、6、12、18、24、30、36、42和48 h；每個(gè)處理重復(fù)3次。處理完畢，離心，棄上清，將愈傷倒在干凈的培養(yǎng)皿中，用濾紙吸去愈傷中的水，稱重。抗氧化劑的處理方式為在暗室中浸泡處理2 h[15]，CAT的濃度為1 000 U[16]， NAC的濃度為1 mmol/L[17]。表1

表1 抗氧化劑處理方式

Table 1 Antioxidants treatments

葉片編號(hào)蒸餾水處理(h)CAT前處理(h)NAC前處理(h)FeCl3處理(mM)暗室放置(h)120001822001 61830201 61840021 618

1.2.3 Z DAB染色

稱取0.1 g的愈傷組織，分別用0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mM的FeCl3溶液(以不加愈傷組織的相應(yīng)濃度的FeCl3溶液作為相應(yīng)處理組的對(duì)照)0.4 mL暗孵育12 h，加入1 mg/mL DAB溶液(溶于pH 3.8的Tris-HCl溶液)，黑暗條件下染色8 h，用酶標(biāo)儀(Thermo 3001，美國(guó))在390 nm處測(cè)定其吸光值，每個(gè)處理重復(fù)3次。其中△OD390=OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組。

1.2.4 白藜蘆醇的提取和檢測(cè)

將稱重后的愈傷組織加適量甲醇，研磨，超聲提取20 min，然后振蕩離心，提取三次，再將上清液收集蒸干，干樣品溶解于甲醇溶液中，用甲醇定容至10 mL容量瓶中。通過(guò)HPLC法對(duì)葡萄葉片中的白藜蘆醇進(jìn)行定量分析，方法參照文獻(xiàn)[13]。上述操作均在避光條件下進(jìn)行。用島津Essentia LC-15C高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)檢測(cè)：將制備的樣品(10 000×g)離心10 min，取上清液過(guò)有機(jī)膜(0.45 μm)，0.2%磷酸水過(guò)水膜(0.45 μm)。色譜條件：采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，B為雙蒸水(0.2%磷酸)，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm。色譜柱 Atlantis C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm， Waters公司 )。洗脫程序：0～4 min，80%～76% B；4～20 min，76%～69% B；20～25 min，69%～60% B。每個(gè)樣品重復(fù)3次。白藜蘆醇含量采用(μg/g 鮮重)表示。

1.2.5 白藜蘆醇茋合酶基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的量效和時(shí)效關(guān)系分別選取0、0.8、1.6和2.4 mM的FeCl3溶液處理葡萄愈傷組織18 h，用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA(天根生化科技有限公司，北京)，參考方法[18]；cDNA第一條鏈合成根據(jù)(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美國(guó)Fermentas 公司)推薦方法[19]進(jìn)行；根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)葡萄白藜蘆醇合成途徑關(guān)鍵酶茋合酶(STS)基因引物[20]，內(nèi)參18 S rRNA基因[21]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照(QuantiFast SYBR Green PCR Kit，QIAGEN)說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。表1

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean values ± S)表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較。

表2 引物序列

Table 2 Primer sequences table

引物縮寫(xiě)登錄號(hào)引物序列分子量(KD)STS1DQ3663015’-CGAAGCAACTAGGCATGTGT-3’5’-CTCCCCAATCCAATCCTTCA-3’13418SAF2070535’-TGGCCTTCGGGATCGGAGTAA-3’5’-ATCCCTGGTCGGCATCGTTTAT-3’201

2 結(jié)果與分析

2.1 FeCl3溶液對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇的誘導(dǎo)作用

研究表明，隨著FeCl3溶液濃度的增加，其葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量明顯升高；且1.6 mM FeCl3處理組其含量達(dá)到最大，為210.8 μg/g鮮重；2.0 mM FeCl3溶液處理組含量有所下降但仍整體高于空白組。通過(guò)1.6 mM FeCl3溶液處理不同時(shí)間后測(cè)定愈傷組織中白藜蘆醇的變化，發(fā)現(xiàn)隨著FeCl3溶液暗孵育時(shí)間的增加，白藜蘆醇的誘導(dǎo)量先增加后降低，在18 h時(shí)達(dá)到最高205.7 μg/g，表現(xiàn)出一定的時(shí)效依賴關(guān)系。圖2～4

與空白組相比**P< 0.01

**P<0.01, vs vehicle control

圖2 FeCl3溶液對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇誘導(dǎo)的量效關(guān)系(18 h)

Fig. 2 The dose-effect of FeCl3solution on resveratrol content in grape callus by18 hours treatment

與空白組相比**P< 0.01

**P<0.01, vs vehicle control

圖3 FeCl3溶液(1.6 mM)對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇誘導(dǎo)的時(shí)效關(guān)系

Fig. 3 The time-effect of 1.6 mM FeCl3solution on resveratrol content in grape callus

圖4 1.6 mM FeCl3溶液處理葡萄愈傷組織18 h后HPLC

Fig. 4 The HPLC analysis of grape callus with 1.6 mM FeCl3solution treatment for 18 h

2.2 FeCl3溶液對(duì)葡萄白藜蘆醇合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)

為了明晰FeCl3溶液對(duì)葡萄愈傷白藜蘆醇誘導(dǎo)與白藜蘆醇合成途徑的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)對(duì)白藜蘆醇合成關(guān)鍵酶STS的基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)STS的表達(dá)量隨著FeCl3溶液濃度的升高而升高，具有明顯的量效關(guān)系，最高STS表達(dá)量出現(xiàn)在2.4 mM FeCl3溶液濃度處理組。圖5

2.3 DAB染色的結(jié)果

DAB可以與過(guò)氧化氫和三價(jià)鐵離子反應(yīng)，在390 nm處測(cè)定吸光值。隨著FeCl3溶液濃度的增加，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光值均增大，且△OD390值也存在增加的趨勢(shì)。表明FeCl3溶液會(huì)使愈傷組織產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而產(chǎn)生過(guò)氧化氫的量與FeCl3溶液的濃度呈正相關(guān)。圖6

與空白組相比*P< 0.05，**P< 0.01

*P<0.05, **P<0.01, vs vehicle control

圖5 FeCl3溶液對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇合成酶(STS)基因表達(dá)

Fig. 5 The effect of FeCl3solution on stilbene synthase gene (STS) expression in grape callus by 18 hours treatment

與空白組相比*P< 0.05，**P< 0.01

*P<0.05, **P<0.01vs vehicle control

圖6 DAB染色后紅地球葡萄葉片愈傷組織中的△OD390值

Fig. 6 The values of △OD390in grape callus stained by DAB

2.4 抗氧化劑預(yù)處理后葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的含量變化

基于之前葡萄愈傷組織白藜蘆醇含量升高與FeCl3溶液的時(shí)效和量效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)研究選用1.6 mM的FeCl3溶液暗孵育18 h。CAT是H2O2的特異性的清除酶，NAC是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)的前體物質(zhì)，兩者都是活性氧的清除劑?？梢钥闯?，抗氧化劑CAT和NAC預(yù)處理后葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的含量較1.6 mM FeCl3溶液?jiǎn)为?dú)處理組明顯降低，表明引起氧化脅迫和茋類物質(zhì)的積累存在一定的相關(guān)性。圖7

與空白組相比**P< 0.01，與FeCl3組相比##P< 0.01

**P<0.01compared with the control group,##P< 0.01 compared with the FeCl3group

圖7 抗氧化劑預(yù)處理后葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的含量變化

Fig.7 The change of resveratrol content after antioxidants pretreatment in grape callus

3 討 論

實(shí)驗(yàn)材料采用紅地球葡萄的繼代愈傷組織，愈傷組織細(xì)胞本底物質(zhì)含量低，施加外界誘導(dǎo)因素易于觀察本底物質(zhì)含量變化。愈傷組織細(xì)胞為脫分化的細(xì)胞，較葉片或其他植物組織更易于進(jìn)行誘導(dǎo)。此外，愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境一致，受外界影響小，更易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較和結(jié)果分析。

鐵元素是葡萄所需要的大量元素，且Fe3+有一定的氧化性、無(wú)毒等優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)FeCl3溶液能引起紅地球葡萄葉片愈傷組織茋類物質(zhì)顯著積累，且白藜蘆醇的積累與FeCl3溶液存在量效和時(shí)效依賴關(guān)系，增加了葡萄茋類物質(zhì)積累的非生物誘導(dǎo)劑的范圍。高濃度(2.0 mM )FeCl3溶液誘導(dǎo)量反而下降，這與Adrian等[1,8]使用氯化鋁和黃芳愛(ài)等[6]使用H2O2作為葡萄白藜蘆醇誘導(dǎo)劑的研究結(jié)果類似，其原因可能是隨著處理濃度和時(shí)間的增加，葉片損傷程度加重會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)效果減弱。茋類物質(zhì)是通過(guò)苯丙氨酸途徑合成，而已知葡萄STS基因均具有誘導(dǎo)表達(dá)的特性，即在一般條件下其合成途徑被關(guān)閉，只有受到病原菌或各種誘發(fā)因子誘導(dǎo)后合成才被激活，此時(shí)茋類化合物在受激部位的含量顯著增加[22,23]。研究中FeCl3溶液對(duì)葡萄STS轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)量效關(guān)系明確而又顯著，解釋了FeCl3溶液促進(jìn)了茋類物質(zhì)白藜蘆醇的合成部分原因。同時(shí)FeCl3溶液具有低毒、易于在植株上操作、作用可靠等優(yōu)點(diǎn)，F(xiàn)eCl3溶液可以作為葡萄葉片愈傷組織白藜蘆醇的有效誘導(dǎo)劑。

在已有報(bào)道中，非生物誘導(dǎo)方式中以紫外(UV)對(duì)茋類物質(zhì)的誘導(dǎo)最為顯著[1]。Tang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)UV脅迫既會(huì)誘導(dǎo)花生幼苗葉片中白藜蘆醇的積累，又會(huì)誘導(dǎo)其H2O2和O2-的積累。研究DAB染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)FeCl3溶液也可以提高葡萄愈傷組織中活性氧的水平進(jìn)而引起其氧化脅迫。而加入活性氧清除劑CAT和NAC預(yù)處理后，F(xiàn)eCl3組的愈傷組織中白藜蘆醇的含量明顯降低。CAT是H2O2的特異性的清除酶，NAC是細(xì)胞內(nèi)還原力谷胱甘肽(GSH)的前體物質(zhì)，二者均能夠有效減少活性氧產(chǎn)生[24]。通過(guò)DAB染色與加入活性氧清除劑CAT和NAC預(yù)處理的研究結(jié)果，正反兩個(gè)方向驗(yàn)證了FeCl3溶液誘導(dǎo)葡萄葉片愈傷組織中茋類物質(zhì)白藜蘆醇的積累和其引起氧化脅迫存在一定相關(guān)性。

4 結(jié) 論

白藜蘆醇作為植保素對(duì)葡萄的抗病防衛(wèi)有著重要的作用。FeCl3溶液對(duì)紅地球葡萄葉愈傷組織白藜蘆醇積累具有顯著升高作用，其積累機(jī)制與FeCl3所導(dǎo)致的氧脅迫正相關(guān)。FeCl3溶液在葡萄的貯存、保鮮上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Fund project:Supported by NSFC (31160058) and science and technology research projects in key fields of XPCC (2014BA029)

The Relationship between FeCl3-induced Resveratrol Accumulation and Oxidative Stress in Grapevine Callus

LI Yue-rong1, LI Rong-fei1, ZHANG Bo1,2, LI Di-di1, WANG Xiao- qin1

(1.CollegeofPharmacy,ShiheziUniversity.ShiheziXinjiang832002,China;2.KeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,CollegeofPharmacy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

【Objective】 To find a resveratrol elicitor on grape, present study takes an preliminary work for developing antistaling agents in grape storage.【Method】The detached grape leaf callus (VitisviniferaL.cv.Red Globe) were treated with different concentrations of FeCl3aqua solution. The content of resveratrol in samples was analyzed by HPLC assay. The biosynthetic regulation of stilbenes was determined as the quantity of stilbene synthase (STS) by realtime PCR methods. ROS levels were detected with DAB stain method.【Result】The results showed that resveratrol accumulated significantly in both dose- and time-dependent manners with FeCl3treatments. Furthermore, the maximum content of resveratrol reached 210.8 μg/g achieved by 1.6 mM plus 18 hours treatment in treated grape callus, whose content is was 8.5-fold higher than untreated samples. It showed that ROS levels in the FeCl3treatments were higher than those untreated. ROS scanvagers CAT and NAC significantly reduced resveratrol content in FeCl3treatments.【Conclusion】Therefore, FeCl3solution has significantly increased resveratrol accumulation in the grape leaf callus via an accumulation mechanism positive related to oxidative stress.

resveratrol; FeCl3solution; grape callus; oxidative stress.

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.020

2015-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160058)；新疆兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014BA029)

李月榮(1990-)，四川威遠(yuǎn)人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)制藥，(E-mail)yueronger512@163.com

張波(1978-)，陜西寶雞人，教授，博士，研究方向?yàn)槟[瘤藥理及生物技術(shù)制藥，(E-mail)Bozhang_lzu@126.com

S663.1;S188

A

1001-4330(2016)01-0149-07