蔡蔚然　鄭貴亮#　葛薩薩，2　張國(guó)平　周義德

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·實(shí)驗(yàn)研究·

Nrf2及其信號(hào)通路相關(guān)因子在噪聲性聾大鼠耳蝸的表達(dá)△

蔡蔚然1鄭貴亮1#葛薩薩1，2張國(guó)平1周義德1

【摘要】目的研究Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路相關(guān)因子核因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutas 1，SOD1)、血紅素加氧酶1 (heme oxygenase- 1，HO-1)在噪聲致聾大鼠耳蝸的表達(dá)變化。方法SD大鼠30只，隨機(jī)分為噪聲組15只和正常對(duì)照組15只。正常對(duì)照組不給予噪聲暴露，噪聲組動(dòng)物給予連續(xù)12小時(shí)115 dB SPL的穩(wěn)態(tài)白噪聲暴露，分別于噪聲暴露后1、3、7天對(duì)兩組動(dòng)物進(jìn)行ABR和DPOAE檢測(cè)，并于噪聲暴露7天后取耳蝸組織運(yùn)用RT-PCR技術(shù)及Peggy Sue微量蛋白檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)Nrf2、SOD1、HO-1的表達(dá)。結(jié)果噪聲暴露后1、3、7天，噪聲組大鼠ABR反應(yīng)閾均高于正常對(duì)照組(P<0.05)，噪聲組DPOAE幅值較正常組明顯下降(P<0.05)；噪聲暴露后7天，噪聲組大鼠耳蝸Nrf2、SOD1、HO-1的mRNA表達(dá)(1.11±0.05、1.45±0.12、1.15±0.03)上調(diào)，高于正常對(duì)照組(1.00±0.02、1.10±0.12、0.92±0.08)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Peggy Sue微量檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示噪聲組Nrf2及SOD1、HO-1蛋白含量均高于正常組(P<0.05)。結(jié)論強(qiáng)噪聲暴露后，SD大鼠耳蝸Nrf2基因表達(dá)和蛋白含量升高，Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路下游抗氧化酶SOD1、HO-1基因表達(dá)和蛋白含量也隨即上調(diào)，此改變可能對(duì)噪聲引起的耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激損傷有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】噪聲性聾；Nrf2；超氧化物歧化酶1；血紅素加氧酶1

噪聲引起耳蝸內(nèi)的氧化應(yīng)激可產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，過量的ROS具有細(xì)胞毒性，其不僅可以破壞生物膜磷脂、DNA，還可以引起細(xì)胞內(nèi)的鈣超載、興奮性毒性[1]，激活細(xì)胞凋亡通路，導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡[2]。Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路相關(guān)因子核因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于體內(nèi)組織中，其通過與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，調(diào)節(jié)下游多種抗氧化酶類基因的轉(zhuǎn)錄。Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路在氧化應(yīng)激防御機(jī)制中起著非常重要的作用[2]，研究表明，Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路在老年性聾、藥物性聾[3]以及噪聲性聽力損失中均有一定的保護(hù)作用。然而，目前關(guān)于Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路在噪聲性聽力損失的抗氧化應(yīng)激中的具體機(jī)制尚未完全清楚。本研究利用RT-PCR、Peggy Sue超微量蛋白檢測(cè)系統(tǒng)等分子生物學(xué)技術(shù)，研究噪聲損傷后大鼠耳蝸內(nèi)Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路及下游抗氧化因子的表達(dá)，探討其在噪聲引起的內(nèi)耳損傷中可能發(fā)揮的作用和機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用SPF級(jí)健康SD大鼠30只(海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心提供)，耳廓反射正常，體重200～300 g，雌雄不拘。隨機(jī)分為噪聲組(15只)和正常對(duì)照組(15只)。

1.2主要儀器 信號(hào)發(fā)生器1027型 ( B&K，丹麥)，實(shí)時(shí)頻譜分析儀RTA840型(Norsonic，挪威)，功率放大器FJD360型(FEILO飛樂，上海)，聽性腦干反應(yīng)測(cè)聽儀(Ihsprog/SmartEP測(cè)聽系統(tǒng)，美國(guó))，畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射儀(Ihsprog/SmartOAE測(cè)聽系統(tǒng)，美國(guó))，Real-time PCR檢測(cè)儀(Roche Light Cycler 480II，德國(guó))，Peggy Sue微量蛋白定量分析系統(tǒng)(Protein Simple公司，美國(guó))，低溫冷凍離心機(jī)CT15RE型(HITACHI，日本)。

1.3噪聲暴露方法 將噪聲組動(dòng)物放置在環(huán)境噪聲小于25 dB A的隔聲室內(nèi)，每個(gè)籠子放1只。噪聲采用聲場(chǎng)給聲方式，通過實(shí)時(shí)頻譜分析儀(型號(hào)RTA840)和麥克風(fēng)校準(zhǔn)前置放大器(型號(hào)1201)連續(xù)監(jiān)測(cè)噪聲信號(hào)，時(shí)間和空間上聲強(qiáng)誤差均不超過±1 dB；給予的寬頻穩(wěn)態(tài)白噪聲平均強(qiáng)度為115 dB SPL，連續(xù)暴露12小時(shí)。正常對(duì)照組不給噪聲暴露。

1.4ABR檢測(cè)對(duì)照組及噪聲組大鼠噪聲暴露前、暴露后1、3、7天進(jìn)行雙耳ABR 測(cè)試。記錄電極置于測(cè)試耳耳廓下軟組織，參考電極置于對(duì)側(cè)耳廓下軟組織，地極插入腳跖軟組織內(nèi)，刺激聲為0.10 ms交替短聲，強(qiáng)度從90 dB SPL開始，先以10 dB遞減，然后以5 dB遞減，以能分辨出波Ⅲ的最低刺激強(qiáng)度為ABR閾值，并重復(fù)檢測(cè)2次。

1.5DPOAE檢測(cè)對(duì)照組及噪聲組大鼠噪聲暴露前、暴露后1、3、7天分別進(jìn)行DPOAE檢測(cè)。方法：麻醉后的大鼠置于隔聲室，刺激聲強(qiáng)度L1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL，f1/f2=1.22，數(shù)據(jù)分析以f2頻率為準(zhǔn)，取783、1 105、1 560、2 211、3 125、4 416、6 250和8 837 Hz共8個(gè)頻率點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，每耳系統(tǒng)自動(dòng)重復(fù)測(cè)2次，疊加32次，記錄各頻率左、右耳的平均DPOAE反應(yīng)幅值。

1.6耳蝸組織取材噪聲暴露后7天完成ABR及DPOAE測(cè)試后，動(dòng)物麻醉下斷頭，取出雙側(cè)聽泡，放入4 ℃預(yù)冷PBS，在解剖顯微鏡下由蝸尖至蝸底分離耳蝸外側(cè)壁，直至暴露全耳蝸基底膜，剪除螺旋韌帶，取下基底膜，置于凍存管內(nèi)，迅速放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7RT-PCR檢測(cè) 用Trizol試劑盒提取總RNA，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，37 ℃孵育15分鐘；85 ℃，5 s，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。使用Roche Light Cycler 480II Real-time PCR檢測(cè)儀，按照TaKaRa 的SYBRGreen PCR試劑盒將稀釋5倍的cDNA進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，引物及探針設(shè)計(jì)見表1，反應(yīng)條件為以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析，用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量，檢測(cè)對(duì)照組及噪聲暴露后7天噪聲組大鼠耳蝸核因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutas 1，SOD1)、血紅素加氧酶1 (heme oxygenase- 1，HO-1)的表達(dá)。

表1　HO-1、Nrf2、SOD-1引物序列

1.8Peggy Sue微量蛋白定量分析將Peggy Sue標(biāo)準(zhǔn)裝中的Ladder、5×Fluor Master、DTT按比例混合到0.6 ml的EP管中。按照樣品與混合物4：1的比例加入5×Fluor Master使樣品最終濃度為0.2 mg/ml。將混合好的樣品和Biotinylated Ladder進(jìn)行95 ℃、5 min變性，置于冰上。將100 μl Luminol-S與100 μl Peroxide混合后置于冰上，按照說明書將所有試劑加入到384孔板中，上機(jī)檢測(cè)對(duì)照組及噪聲暴露后7天噪聲組大鼠耳蝸Nrf2及下游HO-1、SOD1與β-actin蛋白灰度值的比值，結(jié)果使用Compass軟件分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組ABR反應(yīng)閾比較噪聲暴露前噪聲組與對(duì)照組ABR反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，噪聲暴露后第1、3、7天噪聲組的ABR反應(yīng)閾顯著增高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2　噪聲組與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)ABR閾值

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.2各組DPOAE檢測(cè)結(jié)果噪聲暴露前兩組DPOAE幅值無明顯差異(P>0.05)；噪聲組噪聲暴露后1天1 105、1 560、2 211、3 125、4 416、6 250、8 837 Hz DPOAE幅值顯著下降(P<0.01)，噪聲暴露后7天這些頻率幅值雖有上升，但與正常組比較差異依然顯著(P<0.05或P<0.01)(表3)。

(n=15只)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3RT-PCR結(jié)果 噪聲暴露后7天噪聲組耳蝸Nrf2、SOD1、HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高，與正常組比較均有顯著差異(P<0.05)(表4)。

表4　對(duì)照組與噪聲組暴露后7天大鼠耳蝸Nrf2、

2.4Peggy Sue微量蛋白定量分析結(jié)果 耳蝸組織Peggy Sue微量蛋白定量分析的代表性結(jié)果見圖1，為便于分析，將所有結(jié)果進(jìn)行量化處理，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，噪聲暴露后7天大鼠耳蝸Nrf2、HO-1、SOD1蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)(表5)。

表5對(duì)照組及噪聲組暴露后7天大鼠耳蝸Nrf2、HO-1、

組別Nrf2(×10-4)HO-1(×10-2)SOD1對(duì)照組0.40±0.080.20±0.060.43±0.08噪聲組暴露后7天2.42±0.13*1.42±0.12*1.89±0.15*

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

圖1　Nrf2及其下游HO-1、SOD1的Peggy Sue

3討論

耳蝸內(nèi)的ROS過量表達(dá)是造成噪聲暴露后耳蝸損傷的最重要原因[4]。噪聲暴露過程中， 由于內(nèi)耳聽毛細(xì)胞的過度驅(qū)動(dòng)及耳蝸血流量減少，細(xì)胞內(nèi)無氧酵解增加，ROS產(chǎn)生過多并在細(xì)胞內(nèi)堆積。強(qiáng)氧化性的ROS可以直接引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和DNA過氧化反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞持續(xù)造成損害[5],嚴(yán)重的可導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡并引起感音神經(jīng)性聽力損失[6]。

Nrf2是細(xì)胞抗氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，正常情況下，胞漿蛋白Keapl將Nrf2以二聚體形式錨定于胞漿中，抑制Nrf2激活。當(dāng)組織和細(xì)胞受到外界刺激，產(chǎn)生過量ROS等物質(zhì)可氧化Keapl上的巰基或磷酸化Nrf2分子中的絲氨酸和蘇氨酸殘基，從而改變Keapl或Nrf2空間構(gòu)象，導(dǎo)致Nrf2與Keap1分離，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移；在核內(nèi)，Nrf2與小分子Maf蛋白結(jié)合形成二聚體，然后再與抗氧化反應(yīng)元件ARE的GCTGAGTCA位結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化酶基因(SOD等)及Ⅱ相解毒酶基因(HO-1等)轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，抵抗氧化應(yīng)激，實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用[7～9]。2011年 Tomofumi等[3]學(xué)者通過對(duì)基因敲除小鼠與正常小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路在慶大霉素藥物性聾、老年性聾等動(dòng)物模型中起到積極的保護(hù)作用。 Fetoni等[10]學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種草本提取物迷迭香酸可以通過增強(qiáng)內(nèi)源性的抗氧化防御系統(tǒng)，激活Nrf2/Keapl-ARE通路，減輕噪聲性聽力損傷，減小聽力閾移。

Nrf2調(diào)控的 SOD及HO-1均為公認(rèn)的重要的抗氧化酶，在體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SOD具有清除強(qiáng)細(xì)胞毒性的超氧化物自由基的作用，SOD1也稱為銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，Cu/Zn SOD)，耳蝸中74%的SOD為SOD1[11]。SOD可轉(zhuǎn)換超氧陰離子自由基生成H2O2，而H2O2可以通過體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)或過氧化氫酶(CAT)解毒成無害的H2O[12]。HO-1是血紅素代謝的關(guān)鍵酶，在一定條件下可將血紅素分解為 CO、膽綠素、Fe2+,而這三種產(chǎn)物均具有抗氧化性，可以中和強(qiáng)氧化性的ROS,在氧化還原失衡的情況下保護(hù)細(xì)胞[13]。Peggy Sue是一種以毛細(xì)管裝置為基礎(chǔ)的全自動(dòng)蛋白檢測(cè)方法，不受樣本基質(zhì)、樣本濃度、檢測(cè)抗體的影響，較傳統(tǒng)Western blot方法更加準(zhǔn)確可靠。Peggy Sue可以檢測(cè)極微量的蛋白，可以在微克的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行匹克級(jí)的蛋白檢測(cè)[14]，極適合蛋白含量極少的耳蝸組織蛋白檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)先通過ABR及DPOAE檢測(cè)，確定強(qiáng)噪聲暴露可導(dǎo)致大鼠聽力下降，在噪聲暴露7天后其ABR反應(yīng)閾及DPOAE幅值雖然仍低于對(duì)照組但較噪聲暴露后1天有所改善，同時(shí)， 耳蝸Nrf2基因的mRNA表達(dá)上調(diào)，蛋白含量增多，引起了Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路下游抗氧化蛋白基因SOD1、HO-1mRNA表達(dá)增多，SOD1及HO-1蛋白含量增高。提示這種變化有利于減少耳蝸內(nèi)的ROS，維持噪聲暴露后耳蝸內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，推測(cè)是強(qiáng)噪聲暴露后耳蝸內(nèi)發(fā)生的一種自我防御機(jī)制。

綜上所述，強(qiáng)噪聲暴露后大鼠聽力顯著降低的同時(shí)，耳蝸Nrf2基因表達(dá)和蛋白含量升高，Nrf2/Keapl-ARE信號(hào)通路下游抗氧化酶SOD1、HO-1基因表達(dá)和蛋白含量也隨即上調(diào)，可能對(duì)噪聲引起的耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)為今后研究噪聲性聾的干預(yù)方法提供了新的思路。

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(2015-07-10收稿)

(本文編輯雷培香)

Expression of Nrf2 and Its Related Factors in the Cochlea of Rats with Noise Induced Hearing Loss

Cai Weiran*, Zheng Guiliang, Ge Sasa, Zhang Guoping, Zhou Yide

(*Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai, 200433, China)

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of Nuclear factor E2 related factor 2 (Nrf2), Superoxide Dismutas 1 (SOD1), and Heme Oxygenase- 1( HO-1) factors related to Nrf2 signaling pathway in noise-induced cochlear injury of rats.MethodsA total of 30 SD rats were randomly and equally assigned into the following 2 groups: noise group and normal control group. The rats in noise group were exposed to an 115 dB SPL continuous steady white noise for 12 hours, then 1 day, 3 days, and 7 days later, the rats receveid the ABR and DPOAE testing after noise exposure. Both RT-PCR and Peggy Sue trace protein detection techniques were used to detect gene expression in Nrf2 / Keapl-ARE signaling pathway and the protein levels by cochlear tissue sampling after noise exposure 7 days later.ResultsThe ABR thresholds in the noise group was higher than those of in normal control group after noise exposure 1,3, and 7 days later (P<0.05). The DPOAE values of noise group were significantly lower than those of normal control group (P<0.05). The up-regulation of expression of Nrf2, SOD1, HO-1 mRNA(1.11±0.05,1.45±0.12,1.15±0.03) in noise group were higher than those of in the normal control group after noise exposure 7 days later (1.00±0.02,1.10±0.12,0.92±0.08), and the differences were statistically significant (P<0.05). And in Peggy Sue trace detection system, we also found SOD1, HO-1 protein levels in noise group were higher than those of in normal control group.ConclusionAfter the noise-induced cochlear injury in rat, Nrf2 expression in the cochlea increased and up-regulatd expression of downstream gene and protein content such as antioxidant enzymes SOD1 and HO-1gene by regulating Nrf2 / Keapl-ARE signaling pathway, which may be involved in protection against oxidative stress injury in noise-induced cochlear injury of rat.

【Key words】Noise-induced hearing loss;Nrf2;SOD1;HO-1

【中圖分類號(hào)】R764.43+3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1006-7299(2016)02-0153-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.011

作者簡(jiǎn)介：蔡蔚然，女，河南人，碩士研究生，研究方向?yàn)槎茖W(xué)。通訊作者：周義德(Email:ydzhou111@163.com)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-2-116:19

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160201.1619.026.html

△國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81170913)、國(guó)家人力資源和社會(huì)保障部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(2009年)、國(guó)家教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金聯(lián)合資助

1第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科(上海200433)；2上海遠(yuǎn)洋醫(yī)院耳鼻咽喉科

#為并列第一作者