摘 要 為了優(yōu)化紅平菇淀粉酶活力測(cè)定的條件，從pH值、溫度、底物濃度3個(gè)方面對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了單因素分析，并利用響應(yīng)面法進(jìn)行了3個(gè)因子的交互作用分析。結(jié)果表明，測(cè)定紅平菇淀粉酶活力的最優(yōu)條件為pH值5.9、溫度69.85℃、酶量1.2 mL。

關(guān)鍵詞 紅平菇；淀粉酶活力；測(cè)定條件；優(yōu)化；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：Q556 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.34.014

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紅平菇（Pleurotus djamor）是擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、傘菌目、口蘑科、側(cè)耳屬的一種木材腐朽真菌，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，夏秋季節(jié)生長(zhǎng)在多種闊葉樹(shù)的枯干上，也能生長(zhǎng)在棕櫚、橡膠樹(shù)和竹子上，在世界上許多熱帶和亞熱帶地區(qū)均有分布[1-3]。紅平菇屬于珍稀蕈菌，具有很高的食藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值，子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，高蛋白、低脂肪，纖維素含量達(dá)到25%以上，且含多種人體必需的氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌、提高機(jī)體免疫力等功能，產(chǎn)量與生物學(xué)效率高[4-8]。

近二十多年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)紅平菇的研究開(kāi)展得比較廣泛。1991年，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系的李明等人從泰國(guó)引進(jìn)一株高溫型T1紅平菇，通過(guò)3年的研究，掌握了該菌株的生物學(xué)特性[7]。1994年，胡文華在紅平菇Y(jié)PH9菌株栽培技術(shù)上進(jìn)行了一些摸索[9]；同年，李中岳發(fā)表了紅平菇C903菌株人工栽培的報(bào)道[10]。1996年，柳會(huì)珍也對(duì)紅平菇C903菌株的栽培技術(shù)進(jìn)行了報(bào)道[11]。1995年，張其昌等對(duì)紅平菇RQ-1菌株進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)成分分析[12]。2000年，賴(lài)萬(wàn)年進(jìn)行了紅平菇深層發(fā)酵培養(yǎng)的研究，也對(duì)紅平菇在哈爾濱乃至東北地區(qū)液體菌種栽培技術(shù)進(jìn)行了研究[13]。2009年，池玉杰和閆洪波對(duì)紅平菇木質(zhì)素降解酶、錳過(guò)氧化物酶等進(jìn)行了檢測(cè)[14]。但關(guān)于紅平菇酶活力測(cè)定方面的研究報(bào)道還很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用響應(yīng)面法摸索最適的測(cè)定淀粉酶活力的條件，以期為更好地測(cè)定紅平菇淀粉酶活力提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種及其來(lái)源

供試紅平菇菌種為實(shí)驗(yàn)室保藏，菌種于4℃保存于PDA斜面培養(yǎng)基上。

1.1.2 主要試劑及儀器

酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉和檸檬酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。主要儀器有恒溫烘箱、分光光度計(jì)、pH計(jì)等。

1.1.3 紅平菇發(fā)酵液的制備

紅平菇菌種活化后，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，165 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，用抽提機(jī)抽提第9天的液體菌種濾液作為酶液。用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色皿法來(lái)測(cè)定淀粉酶活力。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[15]

1.2.1.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

配制0.5 mg/mL葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣，在一系列管中分別加入3 mL DNS以及不同配比的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，在沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容至25 mL。在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值，OD550作為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg/mL）作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。

1.2.1.2麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

配制1 mg/mL麥芽糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣，在一系列管中分別加入3 mL DNS以及不同配比的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，在沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容至25 mL。在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值，OD520作為橫坐標(biāo)，麥芽糖含量（mg/mL）作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖2）。

1.2.2 緩沖溶液的配制

配制磷酸二氫鈉和檸檬酸緩沖溶液，首先稱(chēng)取一定量磷酸二氫鈉溶于水，將磷酸二氫鈉溶液定容到1000 mL搖勻；然后再稱(chēng)一定量的檸檬酸溶于水，將檸檬酸溶液也定容到1000 mL；最后通過(guò)控制2種溶液加入的量，配制成pH值為4.0， 4.4， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0的六個(gè)不同pH值緩沖溶液。

1.2.3 淀粉酶活力測(cè)定的單因素試驗(yàn)

選取紅平菇出菇第9天測(cè)其淀粉酶活力。依次以pH、溫度及酶量3個(gè)因素做單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定3個(gè)因素的變化對(duì)淀粉酶活力的影響[16-17]。

1.2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)中因素水平對(duì)淀粉酶活力的影響

采用依據(jù)“1.2.3”單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用design-expert軟件設(shè)計(jì)出來(lái)的三因素三水平的響應(yīng)面法，對(duì)淀粉酶活力測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化[18]，其實(shí)驗(yàn)因子和水平見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1pH對(duì)淀粉酶活力的影響

由表2可見(jiàn)，pH值為6.0時(shí)淀粉酶活力最大，pH值小于或者大于6.0，都會(huì)抑制酶的活性。

2.2溫度對(duì)淀粉酶活力的影響

由表2可見(jiàn)，淀粉酶活力測(cè)定的最適溫度為70℃，溫度低于這個(gè)值，酶不能充分激活，溫度高于這個(gè)值，酶活力就降低了。

2.3酶量對(duì)淀粉酶活力的影響

由表2可見(jiàn)，當(dāng)酶量為1.2 mL時(shí)淀粉酶活力最大。

2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中各因素水平對(duì)淀粉酶活力的影響

在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照上面的響應(yīng)面水平和實(shí)驗(yàn)因子進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

采用design-expert軟件進(jìn)行方差分析[18]，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

經(jīng)過(guò)表4三因子的擬合得到回歸方程：酶活力（R1）=5.73-0.073A-0.040B-0.11C+0.039AB-0.11AC-0.054BC-0.90AA-0.73BB-0.32CC。從回歸分析結(jié)果可知，方程回歸顯著。

模型的校正決定系數(shù)R2>99.9999%，說(shuō)明這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，使用該方程模擬真實(shí)的三因子三水平的分析是可行的。

由表3的prob值可知，AA、BB、CC對(duì)酶活力（R1）值的影響非常顯著，表明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，二次項(xiàng)影響非常顯著，交互作用的影響相對(duì)較小。

圖3～圖5直觀地給出了各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面的3D和等值線(xiàn)分析。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線(xiàn)可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線(xiàn)最小橢圓的中心點(diǎn)。

從圖3可見(jiàn)，A和B的交互作用較強(qiáng)。溫度過(guò)高、過(guò)低和酶量過(guò)少、過(guò)多，可能對(duì)會(huì)酶活力產(chǎn)生影響。

從圖4可見(jiàn)，A和C的交互作用不強(qiáng)，A的編碼值在C很大范圍內(nèi)都能得到較大的響應(yīng)值。溫度過(guò)高、過(guò)低和pH值過(guò)高、過(guò)底，可能對(duì)會(huì)酶活力產(chǎn)生影響。

從圖5可見(jiàn)，B和C的交互作用不強(qiáng)，B的編碼值在C的很大范圍內(nèi)都有較大的響應(yīng)值，因子C對(duì)響應(yīng)值影響最大，這與方差分析的結(jié)果吻合。

由以上響應(yīng)面分析得出：淀粉酶活力R1的最大值為5.14127 U，相應(yīng)的溫度A=69.85℃、酶量B=1.20 mL、pH C=5.90。

3小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅平菇淀粉酶活力測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)響應(yīng)面法得出DNS法測(cè)定酶活力的最適條件為：溫度69.85℃，酶量1.2 mL，pH值5.9。單因素及響應(yīng)面法得到的紅平菇淀粉酶活力測(cè)定最適條件，可為紅平菇淀粉酶類(lèi)的測(cè)定和利用提供一定的參考依據(jù)，也可為科學(xué)了解紅平菇營(yíng)養(yǎng)生理習(xí)性及食用菌工業(yè)發(fā)酵菌種的選育提供參考依據(jù)和分析方法。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）