李善昌，吳　騫，丁元圣，孫　宇，閆　磊

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科,黑龍江 佳木斯 154002)

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AKT和HK2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)①

李善昌，吳騫，丁元圣，孫宇，閆磊

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科,黑龍江 佳木斯 154002)

摘要：目的： 探討AKT、HK2在口腔鱗癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況，并對(duì)其表達(dá)水平與臨床特征之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，探討其與口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：應(yīng)用病例對(duì)比設(shè)計(jì)，采用免疫組化SP法對(duì)50例口腔鱗癌石蠟標(biāo)本及20例癌旁正常組織中AKT、HK2蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行研究，使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)而分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果： AKT,HK2在病例組中表達(dá)明顯高于對(duì)照組。AKT與HK2表達(dá)與細(xì)胞分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部侵襲性相關(guān)，差異結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。結(jié)論：AKT,HK2在口腔鱗癌中的表達(dá)上調(diào)，AKT與HK2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：口腔鱗癌；AKT；HK2；免疫組化

口腔鱗癌是頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞的早期診斷，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及預(yù)后生存分析有獨(dú)特作用[1,2]。在絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中，即使在氧氣充足的條件下，糖酵解代謝也異?；钴S，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖提供能量，稱(chēng)為Warburg效應(yīng)，目前這一效應(yīng)已經(jīng)成為了許多惡性腫瘤的顯著特征[3]。糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵因子葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporter,GLUT)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、乳酸脫氫酶(lactate dehygrogenase,LDH)等在許多癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其中HK在口腔癌中的研究還比較少。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT 即蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB)通路，也就是PI3K-AKT通路，參與了糖酵解酶HK的上游調(diào)控，所以HK2與AKT在糖酵解過(guò)程中扮演重要角色，二者與腫瘤關(guān)系密切。

1材料和方法

1.1材料

選取在佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)院收治的口腔鱗癌患者50例，其中男34例，女16例，年齡≤60歲22例，年齡>60歲28例。所有患者均有完整的臨床病理資料且術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放化療。采用TNM 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ~Ⅱ期31例、Ⅲ~Ⅳ期19例；病理分級(jí)，分為高分化30例，中~低分化20例；經(jīng)病理檢查證實(shí)有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的29例，未轉(zhuǎn)移的21例；另外選擇20例癌旁正常組織作為對(duì)照組。癌旁組織取自距癌組織>1cm處。所有病理標(biāo)本經(jīng)HE染色后由兩位高年資病理科醫(yī)生復(fù)診，均證實(shí)為口腔鱗狀細(xì)胞癌。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠抗人HK2多克隆抗體，兔抗人AKT多克隆抗體，試劑盒(SP-9000)，DAB 試劑盒。

1.3免疫組化檢測(cè)

全部組織樣本均行常規(guī)固定, 包埋, 連續(xù)切片, 抗原修復(fù), SP法染色。選擇用試劑公司提供的已知高表達(dá)陽(yáng)性切片在同一條件下作為陽(yáng)性參照, 選擇PBS替代一抗作為陰性參照。免疫組化染色步驟按試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行染色。

1.4結(jié)果判定

AKT,HK2陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色或棕色團(tuán)塊。采用雙盲法讀片,隨機(jī)在顯微鏡下選取5個(gè)100視野，每個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè),計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性個(gè)數(shù)百分率：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%記為(-)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10%及以上的均記為(+)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均，蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況與其它臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)分析，AKT與HK2兩種蛋白之間表達(dá)的關(guān)系應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析檢測(cè)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1AKT在口腔鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

AKT在腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色主要定位在胞漿，為棕黃色或棕色團(tuán)塊。在口腔鱗癌組中陽(yáng)性表達(dá)率為72%,見(jiàn)圖1。在正常口腔黏膜組中陽(yáng)性表達(dá)率為40%。兩組間結(jié)果不同，有意義 (P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1　AKT在口腔鱗癌中的表達(dá)(×200)

2.2AKT的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

高分化者陽(yáng)性率為55%(11/20)，中、低分化者陽(yáng)性率約為83.3%(25/30)，(P<0.05)。TNM分期中，I-II期陽(yáng)性表達(dá)率約為61.2%(19/31)，III-IV期陽(yáng)性表達(dá)率為89.4%(17/19), (P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率約為82.7%(24/29)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率約為57.1%(12/21), (P<0.05),有局部侵襲性組陽(yáng)性表達(dá)率約為83.3%(25/30),無(wú)局部侵襲性組陽(yáng)性表達(dá)率約為55%(11/20)，(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3HK2在口腔鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

HK2在腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色主要定位在胞漿，為棕黃色或棕色團(tuán)塊。在口腔鱗癌組中陽(yáng)性表達(dá)率為66%，見(jiàn)圖1。在正?？谇火つそM中陽(yáng)性表達(dá)率為35%。兩組間結(jié)果不同，有意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.4HK2的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

高分化者陽(yáng)性率為45%(9/20)，中、低分化者陽(yáng)性率約為80%(24/30)，(P<0.05)。TNM分期中，I-II期陽(yáng)性表達(dá)率約為54.8%(17/31)，III-IV期陽(yáng)性表達(dá)率為84.2%(16/19), (P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率約為82.7%(24/29)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率約為42.8%(9/21), (P<0.05) 有局部侵襲性組陽(yáng)性表達(dá)率約為80%(24/30),無(wú)局部侵襲性組陽(yáng)性表達(dá)率約為45%(9/20)，(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.5口腔鱗癌組織中AKT蛋白與HK2蛋白的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，AKT蛋白與HK2蛋白在50例口腔鱗癌組織中同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性28例，同時(shí)表達(dá)陰性9例，經(jīng) Spearman 秩相關(guān)性分析，二者呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.004,r=0.399),見(jiàn)表3。

表2　AKT和HK2表達(dá)與口腔鱗癌臨床病理的關(guān)系

圖2　HK2在口腔鱗癌中的表達(dá)(×200)

HK2AKT+-rP+2850.399<0.05-89

3討論

AKT蛋白是一種絲/蘇氨酸激酶,是細(xì)胞內(nèi)病毒原癌蛋白一的同族體[4]，它在PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于核心地位, 參與細(xì)胞的周期性調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)代謝、增殖、凋亡等多種生物學(xué)活性，此蛋白的異常表達(dá)是造成腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[5]。哺乳動(dòng)物基因組包括3種 AKT 基因，編碼 AKT1(PKBα)、 AKT2(PKBβ) 、AKT3(PKBγ) 異構(gòu)體，同源性達(dá)80%以上[6]。其中，糖酵解代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶HK就是AKT控制的下游分子之一，兩者在促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和抑制凋亡中起到關(guān)鍵作用。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道AKT還可以維持HK的高活性，提示說(shuō)明兩者可能在癌癥發(fā)展過(guò)程中有協(xié)同作用，這與本實(shí)驗(yàn)中AKT與HK2在50例口腔鱗癌中的表達(dá)情況經(jīng)Spearman相關(guān)性分析認(rèn)為二者呈顯著性正相關(guān)的研究結(jié)果相一致。并且AKT的陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)類(lèi)型、細(xì)胞分化程度、臨床分期,局部侵襲性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

HK2在許多生長(zhǎng)迅速的惡性腫瘤細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)[7]，例如乳腺癌、肺癌、宮頸癌[8~10]等。HK家族分四個(gè)亞型，分別是HK1,HK2,HK3,HK4,但只有HK2對(duì)葡萄糖最具親和力并且其催化能力最強(qiáng)。它是糖酵解化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中第一個(gè)最關(guān)鍵的重要酶，將所有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖完全催化反應(yīng)成為6-磷酸葡萄糖，在通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生大量能量和中間代謝產(chǎn)物以滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞分裂增殖的需求。同時(shí)有研究表明,AKT可以促進(jìn)HK2與線(xiàn)粒體的結(jié)合，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的HK2黏附在線(xiàn)粒體外膜(OMM)上,并與線(xiàn)粒體外膜通道蛋白VDAC1發(fā)生結(jié)合,從而發(fā)揮其抑制凋亡效應(yīng)。其次，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中HK2蛋白陽(yáng)性率顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，且HK2的陽(yáng)性表達(dá)隨著病理分級(jí)的降低、臨床分期的增高而明顯增強(qiáng)，提示HK2蛋白表達(dá)上調(diào)在口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起一定作用，這與許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究相似。

綜上所述， AKT和HK2蛋白均可能成為檢測(cè)口腔鱗癌的重要指標(biāo)，并且為惡性腫瘤的靶向治療提供一種可能。

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The expression and significance of AKT and HK2 proteins in oral squamous cell carcinoma

LIShan-chang,WUQian，DINGYuan-sheng，SUNYu，YANLei

(The Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154002，China)

Abstract:Objective: To examine the expression and clinical and pathological significance of PTEN and PI3K in oral squamous cell carcinoma(OSCC). Methods: The Expression levels of PTEN, PI3K protein were determined by using immunohistochemistry SP in 52 cases of OSCC and 20 specimens of normal oral mucosa tissues. The correlation between PTEN and PI3K protein and between the two markers and clinical and pathological parameters were analyzed. Results: AKT, HK2 expression was significantly higher in the patient group. AKT and HK2 expression was related with cell differentiation, clinical stage, lymph node metastasis and local invasiveness. The difference was statistically significant. Conclusion:AKT, HK2 expression in oral squamous cell carcinoma. AKT was positively correlated with protein expression of HK2.

Key words:oral squamous cell carcinoma;AKT;HK2

(收稿日期：2015-09-18)

中圖分類(lèi)號(hào)：R739.85

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)01-0019-03

作者簡(jiǎn)介:李善昌(1969～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。通訊作者:吳騫(1991～)男，遼寧沈陽(yáng)人，在讀碩士研究生。E-mail:1755372155@qq.com。

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：12521553。