謝麗云，鄭　茂

(1.岳陽市第一人民醫(yī)院，湖南 岳陽 414000；2.湖南省血吸蟲病防治所，湖南 岳陽 414000)

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日本血吸蟲感染小鼠TGF-β1動態(tài)變化研究①

謝麗云1，鄭茂2

(1.岳陽市第一人民醫(yī)院，湖南 岳陽 414000；2.湖南省血吸蟲病防治所，湖南 岳陽 414000)

摘要:目的：觀察日本血吸蟲感染小鼠中TGF-β1濃度的變化，探討其在肝纖維化中的作用。 方法：建立小鼠日本血吸蟲病肝纖維化模型，采用ELISA法檢測小鼠感染后0、6、12、21周及治療后9周TGF-β1濃度。 結(jié)果：不同病期血吸蟲病小鼠模型的感染成功率為100%。小鼠感染后0、6、12、21周及治療后9周的TGF-β1濃度分別是(0.45±0.07)ng/L、(0.82±0.09)ng/L、(1.35±0.12)ng/L、(1.61±0.10)ng/L和(0.50±0.06)ng/L。 結(jié)論：血吸蟲病感染小鼠血清中的TGF-β1濃度隨著感染時間的延長而增加，用藥后明顯下降，提示其可能具有病情評估意義。

關(guān)鍵詞:日本血吸蟲?。桓卫w維化；轉(zhuǎn)化生長因子β1

日本血吸蟲感染宿主導(dǎo)致的肝纖維化和肝硬化是血吸蟲病患者死亡的主因[1]。相關(guān)研究表明炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)是血吸蟲病肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要原因[2]，TGF-β1作為該網(wǎng)絡(luò)成員之一，可能是肝纖維化的關(guān)鍵因子，但目前國內(nèi)尚無TGF-β1在血吸蟲病肝纖維化小鼠血清中動態(tài)變化的研究報道。本研究擬通過觀察小鼠日本血吸蟲病肝纖維化模型中TGF-β1的動態(tài)變化，探討其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，為今后血吸蟲病免疫機制相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1標本來源

6～8周健康雄性昆明小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體重18~22g；陽性釘螺購自江蘇省寄生蟲病研究所。隨機選10只作為陰性對照組，剩余小鼠經(jīng)皮感染(20±1)條日本血吸蟲尾蚴。感染后第6、12、21周各隨機選10只行眼球摘取法取全血后處死(治療組小鼠于感染后第12周開始予300mg/kg·d吡喹酮灌藥治療后第9周處死)。全血離心后收集血清保存在-70℃超低溫冰箱；取小鼠肝臟右葉上緣的一塊放入疊氮鈉中保存制成石蠟切片，剩余的用鑷子撕碎收集蟲體并記錄全部蟲體數(shù)(包括腸系膜靜脈內(nèi)蟲體)。

1.2主要試劑

蘇木素、伊紅購自碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠TGF-β1酶聯(lián)試劑盒購自長沙艾杰生物公司。

1.3方法

①HE染色：石蠟切片→脫蠟水化→蘇木素染色→伊紅染色→脫水透明→封片鏡檢。②血清TGF-β1濃度測定：按照ELISIA試劑盒說明書進行操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組小鼠中的蟲體檢出數(shù)

6w組蟲體檢出數(shù)為(14.7±2.7)條，12w組(13.8±2.8)條，21w組(13.3±2.4)條，治療組(0.8±0.5)條，小鼠模型感染成功率達到100%。

2.2各組小鼠肝臟表面肉眼可見病變

各組小鼠肝表面肉眼所見的變化如圖1所示。對照組小鼠肝臟呈肉紅色，邊緣光滑，質(zhì)地柔軟有彈性；6W組肝臟轉(zhuǎn)呈暗紅色甚至褐色，邊緣不整齊，表面顆粒狀結(jié)節(jié)清楚，質(zhì)地變硬；12W組肝臟為深褐色甚至黑褐色，邊緣不齊，表面分布顆粒狀結(jié)節(jié)、結(jié)節(jié)清晰且大小不一致，質(zhì)地堅硬；21W組肝臟顏色為黑褐色，邊緣不齊，表面的顆粒狀結(jié)節(jié)極其少見，質(zhì)地堅硬；治療組小鼠肝臟顏色為深褐色，邊緣不齊，表面無明顯可見的顆粒結(jié)節(jié)，質(zhì)地堅硬。

圖1　各模型鼠肝表面肉眼所見病變

2.3HE染色

肝臟纖維化從輕到重分為S0~S4共5個級別(圖2)。對照組小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)正常，細胞呈放射狀分布，沒有出現(xiàn)腫脹、變性及壞死等現(xiàn)象。感染后6w小鼠肝臟開始有蟲卵肉芽腫形成，主要分布在肝臟小葉間靜脈內(nèi)或匯管區(qū)，血吸蟲蟲卵周圍有炎性細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞最為常見，同時可發(fā)現(xiàn)少量膠原纖維圍繞在肉芽腫周圍。感染12w后成纖維細胞逐漸取代嗜酸性粒細胞成為蟲卵肉芽腫的主要細胞組成，膠原纖維仍然包繞蟲卵肉芽腫，呈網(wǎng)狀、條索狀向四周延伸。感染后21w可見大部分小鼠肝臟中的蟲卵和炎性細胞逐漸消失，膠原沉淀有所降解，開始形成穩(wěn)定的肝纖維化。用藥組未見有蟲卵肉芽腫和肝纖維化形成。

圖2　各組小鼠肝臟染色結(jié)果(HE×100)

備注：S0級(基本正常)、S1級(匯管區(qū)纖維化擴大，限局竇周及小葉內(nèi)纖維化)、S2級(匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留)、S3級(纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化)、S4級(早期肝硬化)；箭頭所指處為蟲卵肉芽腫。

各組小鼠肝臟纖維化分級的分布情況見表1。對照組10例均為S0級；感染后6w組9例為S1級、1例為S2級；12w組4例為S1級、6例為S2級；21w組4例為S3級、6例為S4級；治療組3例為S2級、5例為S3級，提示血吸蟲病肝纖維化在急性肉芽腫向慢性肉芽腫過度的過程中纖維逐漸增加，早期適時吡喹酮治療能有效阻止肝臟纖維組織的增生。

表1　各組小鼠肝臟纖維化分級的分布(n=10)

表2　各組小鼠血清中TFG-β1濃度比較

注：P1:與對照組比較; P2:與相鄰TFG-β1濃度較低組比較。

2.4各組小鼠血清中TGF-β1濃度變化

以1.56ng/mL、3.12ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/L、25ng/mL5個TGF-β1標準品濃度做橫坐標、對應(yīng)的吸光度做縱坐標，繪制標準曲線，算得回歸方程為：y = -0.0008x2+ 0.0589x + 0.0075，R2= 0.9998。根據(jù)標準曲線，得到各組小鼠血清中的TFG-β1濃度，見表2。首先，采用方差分析統(tǒng)計對照組、6w組、12w組、21w組和治療組小鼠的TFG-β1總體差異，結(jié)果顯示五組間的TFG-β1濃度有差異(F=317.20, P<0.01)。接著采用SNK-q檢驗對這五組小鼠的TFG-β1濃度差異進行兩兩間的全面比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除對照組與治療組比較無差異外，其余各組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

本次研究采用小鼠腹部敷貼尾蚴法建模，感染成功率達到100%，建立了符合血吸蟲感染自然演變過程的動物實驗?zāi)Ｐ?，此模型不僅可提高日本血吸蟲病研究結(jié)果的可靠性，且可給其它相關(guān)研究提供幫助。本實驗結(jié)果顯示小鼠感染后6w后形成蟲卵肉芽腫，感染后12w肝纖維化開始形成并進一步發(fā)生發(fā)展，感染后21w開始出現(xiàn)干線型肝纖維化甚至肝硬化，治療組的肝纖維化程度較感染后12w更為嚴重，但與感染后21w組相比有所緩和。由此可以認為本實驗的血吸蟲病感染小鼠模型屬于天然生態(tài)變化模型，且與人體血吸蟲病的臨床發(fā)生轉(zhuǎn)歸相吻合。肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵是肝星狀細胞的激活，肝星狀細胞激活后產(chǎn)生大量間質(zhì)膠原，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的形成與降解失衡，最終導(dǎo)致肝纖維化，而TGF-β1恰好是調(diào)節(jié)肝星狀細胞分泌細胞外基質(zhì)重要因子[3]。本研究顯示小鼠血清中的TGF-β1濃度隨著感染期的延長而增加，且在治療后降低，提示其是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起主要調(diào)節(jié)作用關(guān)鍵細胞因子之一，可作為臨床評估肝纖維化嚴重程度及預(yù)后的輔助指標。

參考文獻:

[1]孫婷,李剛,陳茂劍,等.晚期血吸蟲病患者外周血Vα24自然殺傷T 細胞的變化及其與肝纖維化程度的關(guān)系[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2014, 32 (5): 348-351

[2]宋蘭桂,吳忠道.日本血吸蟲病肝纖維化的病理學(xué)及發(fā)病機制研究進展[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2015, 27 (2): 213-215

[3]Zhao L, Gandhi CR, Gao ZH. Involvement of cytosolic phospholipase A2 alpha signalling pathway in spontaneous and transforming growth factor-beta-induced activation of rat hepatic stellate cells[J].Liver Int, 2011, 31(10):1565-1573

Dynamic changes of TGF-β1 in mice infected with schistosoma japonicum

(XIELi-yun1,ZHENGMao2

((1.The First People’s Hospital of Yueyang, Yueyang 414000,China;2.Hunan Institute of Parasite Disease Control, Yueyang 414000,China)

Abstract:Objective:To observe the changes of TGF-β1 in mice with S.japonicum infection, and to explore its role in liver fibrosis.Methods:We established schistosomiasis liver fibrosis mice model by using ELISA method to detect TGF-β1 at 0, 6, 12, 21 weeks after infection and 9 weeks after treatment.Results:The infection rates in different stages of mice model infected with S.japonicum were 100%. The TGF-β1 concentrations at 0, 6, 12, 21 weeks after infection and 9 weeks after treatment were (0.45±0.07)ng/L,(0.82±0.09)ng/L,(1.35±0.12)ng/L,(1.61±0.10)ng/L and (0.50±0.060ng/L respectively.Conclusion:TGF-beta1 increased with infection period, and reduced after treatment, suggesting that it had significance in disease assessment.

Key words:schistosomiasis; liver fibrosis; TGF-β1

(收稿日期：2015-06-06)

中圖分類號:R383.2+4

文獻標識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)01-0017-02

作者簡介：謝麗云(1985~)女，湖南邵陽人，碩士，主管技師，研究方向：臨床檢驗技術(shù)。

基金項目：湖南省衛(wèi)生廳基金項目，編號：B2013119。