王　坤,陳琪珍,楊劍波,鄂蘇評

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，黑龍江 哈爾濱 150081)

?

MAPKs在丙泊酚后處理減輕大鼠缺血/再灌注損傷中作用①

王坤,陳琪珍,楊劍波,鄂蘇評

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，黑龍江 哈爾濱 150081)

摘要:目的:研究丙泊酚后處理對離體大鼠缺血/再灌注心肌的影響及MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中的作用。方法 ：選用SD大鼠40只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：空白對照組(Control組，n=8)、缺血/再灌注組(I/R組，n=8)、丙泊酚后處理低劑量組(Plow組，n=8)、中劑量組(Pmid組，n=8)和高劑量組(Phigh組，n=8)；采用Langendorff 離體心肌缺血再灌注法建立模型，于續(xù)灌末取下心臟，采用Tunel 法檢測缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡和Western blot 測定Bcl-2、Bax及MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白表達(dá)。結(jié)果:與Control組比較，I/R組心肌細(xì)胞凋亡率(AR)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌細(xì)胞AR顯著較少(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bcl-2表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌Bax表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bax表達(dá)顯著較少(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌組織p-ERK1/2表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-ERK1/2表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌組織p-p38表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-p38表達(dá)顯著較少(P<0.05)。結(jié)論：丙泊酚后處理減少離體大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與激活MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ERK1/2和p38活化)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:MAPKs；丙泊酚后處理；缺血/再灌注；Bcl-2；Bax

急性心肌缺血事件是臨床上麻醉醫(yī)生經(jīng)常面臨的一種病理生理改變，是圍術(shù)期嚴(yán)重的心臟危險事件，也是圍術(shù)期死亡常見原因。適時進(jìn)行有效再灌注是挽救心肌最有效的方法。但再灌注也加重心肌損傷，即缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)。因此，尋找一種臨床可控性強(qiáng)，又能切實(shí)有效的減輕再灌注損傷的防治措施已成為一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)和臨床課題。在我國，靜脈麻醉藥丙泊酚使用較為普遍。丙泊酚屬于新型非巴比妥類靜脈全麻藥，起效迅速，作用腦部GABA受體—氯離子復(fù)合物，發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，效果安全可靠。目前在臨床麻醉工作中應(yīng)用廣泛。以往研究證實(shí)，預(yù)先應(yīng)用丙泊酚于缺血性心肌可以起到心肌保護(hù)作用，在離體實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先應(yīng)用丙泊酚灌注離體心肌，發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以明顯減輕缺血/再灌注心肌的水腫，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。但有關(guān)丙泊酚后處理的心肌保護(hù)作用及該保護(hù)作用是否通過MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前尚不十分清楚。因此深入研究丙泊酚后處理對心肌缺血/再灌注損傷的影響及其作用機(jī)制更具現(xiàn)實(shí)意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組

選用健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體重(200±20)g，16～18月齡，購于北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動物中心。在溫度(23±0.5)℃，濕度為40%~60%，光照與熄燈各12h環(huán)境中適應(yīng)性馴養(yǎng)7d，操作均由固定人員在上午8：00至10：00進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動物的處理符合哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)定和國際實(shí)驗(yàn)動物使用準(zhǔn)則。

選用SD大鼠40只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為為5組：空白對照組(Control組，n=8)，離體心臟在37°C條件下，平衡30min，正常K-H液灌流210min；缺血/再灌注組(I/R組，n=8)，離體心臟在37°C條件下，平衡30min，全心缺血30min，再灌注180min；丙泊酚后處理低劑量組(Plow組，n=8)、中劑量組(Pmid組，n=8)和高劑量組(Phigh組，n=8)，離體心臟穩(wěn)定30min，全心缺血30min，丙泊酚低劑量(60umol·mL-1)、中劑量(100umol·mL-1)和高劑量(150umol·mL-1)的K-H灌注溶液處理2min，洗脫2min，連續(xù)3個循環(huán)后，再灌注168min。

1.2離體大鼠心臟灌注langendorff模型

所有大鼠禁食12h，可以自由飲水。麻醉采用20%烏來糖(腹腔注射1.0g·kg-1)，進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，利多卡因1.0%腹前壁切口處局部侵潤麻醉。然后仰臥位并固定四肢，備皮后消毒，再橫向沿肋緣剪開腹前壁，剪開腹中線向上至劍突，向下剪至膈肌，再縱向沿兩側(cè)鎖骨中線剪開胸腔，逐層分離縱膈前組織，將胸壁前組織翻向頭側(cè)，顯露出心臟，輕柔取出心臟后，立即放于4℃的飽和的K-H緩沖液(用混合氣體95%O2+5%CO2，1.5L·min-1飽和)中反復(fù)漂洗，沖出心臟內(nèi)殘余血液。使用眼科鑷子提起主動脈進(jìn)行插管，連接Langendorff灌注管口，逆行采用恒壓灌注，保持灌注壓10kPa，速度維持在7～10mL·min-1。灌注系統(tǒng)和心肌組織溫度維持在(37±0.5)℃，室溫保持在(25±1)℃。開始灌流數(shù)秒后心臟便開始跳動。1min后剪開左心耳上方，經(jīng)過左心房和二尖瓣，將一頭帶有測壓導(dǎo)管的心室球囊送至左心室，另一端經(jīng)過壓力換能裝置連接到生理記錄儀上。穩(wěn)定后10min后，使用1mL注射器緩慢向左心室球囊內(nèi)注射生理鹽水(40~60μL)，然后調(diào)節(jié)左水囊容積使左心室舒張末期壓力(LVEDP)保持在3~7mmHg范圍內(nèi)，然后維持水囊容積恒定。

選擇離體心臟標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)Langendorff模型平衡灌注15min后，離體心臟HR<200bpm，LVSP<10 kPa，室早或房早>2bpm均排除實(shí)驗(yàn)。

1.3指標(biāo)檢測

采用Tunel 法檢測缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡和Western blot 測定Bcl-2、Bax及MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白表達(dá)。

1.3.1Tunel法檢測心肌細(xì)胞凋亡

取同一部位心肌組織做石蠟切片，鏡下選取3個高倍鏡(×200)視野，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)(棕色核染色即是凋亡細(xì)胞)，以凋亡率(Apoptotic Rate，AR)作為心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)：AR =凋亡細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.2Western blot 測定心肌組織Bcl-2、Bax及MAPKs蛋白表達(dá)

取同一部位心肌組織，研磨后勻漿提取總蛋白，采用BCA方法檢測蛋白質(zhì)濃度。采用loading buffer進(jìn)行沸水浴，5~10min經(jīng)過充分變性，加各組心肌組織蛋白40μg，進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳，電泳條件恒流250mA。采用濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜60 min，到PVDF膜，含5%脫脂奶粉的 TBST 溶液中進(jìn)行封閉，封閉約60min，然后4℃條件下一抗(1:500)過夜，采用TBST溶液洗膜10min×3次，在37℃條件下使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:1 000)進(jìn)行孵育90min，TBST洗膜10 min×3次，選用ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光，最后曝光。目標(biāo)蛋白(Bcl-2、Bax和total-ERK1/2、total-p38、total-JNK及p-ERK1/2、p-p38、p-JNK)條帶與GADPH比值表示其相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 13. 0 的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞凋亡率比較

與Control組比較，I/R組心肌細(xì)胞AR(5.93%)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌細(xì)胞AR(3.11%)顯著較少(P<0.05)，Plow和Phigh組心肌細(xì)胞AR(5.52%和5.24%)無明顯減少，見圖 1。

2.2心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)比較

與Control組比較，I/R組心肌組織Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bcl-2表達(dá)明顯增加(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織Bcl-2表達(dá)無明顯增加， 見圖 2。

與Control組比較，I/R組心肌組織Bax表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織Bax表達(dá)無明顯降低， 見圖 2。

圖1心肌細(xì)胞凋亡率表達(dá)(×200)

圖2　心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

2.3心肌組織MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)比較

與Control組比較，I/R組心肌組織p-ERK1/2表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-ERK1/2表達(dá)明顯增加(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織p-ERK1/2表達(dá)無明顯增加，見圖3。

與Control組比較，I/R組心肌組織p-p38表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-p38表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織p-p38表達(dá)無明顯降低，見圖3。

各組間total-ERK1/2、total-p38、total-JNK及p-JNK蛋白表達(dá)無明顯差異。

圖3　心肌組織MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，中劑量丙泊酚后處理能顯著減少離體大鼠缺血/再灌注心肌組織細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，該保護(hù)作用可能是通過MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ERK1/2和p38)活化來實(shí)現(xiàn)的。

缺血/再灌注損傷所致心肌細(xì)胞凋亡是心肌損傷的重要原因。Bcl-2和Bax是依賴線粒體凋亡途徑中重要的一組調(diào)控基因。Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因，其表達(dá)蛋白位于線粒體膜或核膜及溶酶體膜，可抑制細(xì)胞凋亡[1]。Bax也屬Bcl-2基因家族，但功能與Bcl-2基因相反，Bcl-2有抗凋亡功能，而Bax則有促凋亡作用[2]。Bax與Bcl-2蛋白形成異二聚體，使Bcl-2蛋白失活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡[3,4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：I/R組抗凋亡Bcl-2表達(dá)下降，促凋亡Bax表達(dá)上調(diào)，說明缺血/再灌注損傷促進(jìn)凋亡基因Bax表達(dá)，而抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)受到抑制，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡形成，這與心肌組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果表達(dá)一致。

目前丙泊酚是我們臨床最常用的新型非巴比妥類的靜脈全麻藥，作用于腦內(nèi)GABA受體—氯離子復(fù)合物，使其激活發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠效果，能夠抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、改善心肌細(xì)胞線粒體膜通透性等效果[5]。以往研究證實(shí)，丙泊酚可以清除體內(nèi)自由基、增加機(jī)體抗氧化水平，顯著抑制心肌細(xì)胞肌纖維跨膜鈣離子的內(nèi)流，然后抑制心肌細(xì)胞鈣超載，可以發(fā)揮一定的心肌保護(hù)效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚中劑量組與缺血/再灌注組比較，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，說明丙泊酚通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，對減輕心肌缺血/再灌注損傷，這與以往研究結(jié)果相一致。

目前有關(guān)丙泊酚后處理心肌保護(hù)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不十分清楚。細(xì)胞凋亡是缺血/再灌注過程中心肌細(xì)胞死亡的重要形成機(jī)制，其凋亡的發(fā)生、發(fā)展受絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(mitogen- activated protein kinase，MAPKs)的調(diào)控。該家族主要包括：①細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK1/2)；②蛋白激酶p38(p38)；③c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。這3條主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在心肌缺血/再灌注中發(fā)揮的作用不盡相同：ERK1/2在心肌缺血/再灌注時激活可以起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，阻斷ERK1/2通路可增加心肌細(xì)胞的凋亡[6]；而JNK和p38通路激活后可使細(xì)胞凋亡增加[7]。那么丙泊酚心肌保護(hù)效應(yīng)是否與ERK1/2、 JNK和p38活化有關(guān)呢？目前有關(guān)MAPKs途徑在丙泊酚心肌保護(hù)效應(yīng)中作用的報道較少，且未形成統(tǒng)一觀點(diǎn)。以往研究提示在心肌再灌注時激活ERK1/2途徑可發(fā)揮心肌保護(hù)作用[8,9]。Sun[10]等采用乳鼠的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧后處理抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)JNK和p38 MAPK磷酸化，可減少Bax和凋亡細(xì)胞數(shù)目，提示抑制JNK和p38可減輕缺氧/再灌注所致細(xì)胞凋亡。在本研究中，丙泊酚的劑量我們參照文獻(xiàn)[10,11]選取。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中劑量丙泊酚可增加心肌ERK1/2活性，降低p-38表達(dá)，說明丙泊酚可能通過ERK1/2和p-38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕心肌缺血/再灌注損傷，該結(jié)果與文獻(xiàn)[12]相似，證實(shí)丙泊酚后處理在離體大鼠心肌缺血/再灌注過程中具有心肌保護(hù)作用。

綜上所述，丙泊酚對離體大鼠缺血/再灌注心肌有保護(hù)作用，可減少心肌細(xì)胞凋亡，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能與ERK1/2和p38信號通路活化有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Duan X, Ji B, Yu K. Acidic buffer or plus cyclosporine A postconditioning protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury[J].Perfusion,2011,26(3):245-252

[2]Loor G, Kondapalli J, Iwase H, et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion[J]. Biochim Biophys Acta,2011,1813(7):1382-1394

[3]Hochhauser E, Kivity S, Offen D, et al. Bax ablation protects against myocardial ischemia-reperfusion injury in transgenic mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,284(6): 2351-2359

[4]Moe GW, Naik G, Konig A, et al. Early and persistent activation of myocardial apoptosis, bax and caspases: Insights into mechanisms of progression of heart failure[J]. Pathophysiology, 2008,(3):183-192

[5]Shao H, Li J, Zhou Y, et al. Dose-dependent protective effect of propofol against mitochondrial dysfunction in ischaemic/reperfused rat heart: role of cardiolipin[J]. Br J Pharmacol,2008,153(8):1641-1649

[6]Li DY, Tao L, Liu H, et al. Role of ERK1/2 in the anti-apoptotic and cardioprotective effects of nitric oxide after myocardial ischemia and reperfusion[J]. Apoptosis,2006,11(6):923-930

[7]Pantos C, Malliopoulou V, Paizis I, et al. Thyroid hormone and cardioprotection: study of p38 MAPK and JNKs during ischaemia and at reperfusion in isolated rat heart[J]. Mol Cell Biochem,2009, 242(1-2):173-180

[8]Yang XM, Proctor JB, Cui L, et al. Multiple, brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J]. J Am Coll Cardiol,2004,44(5):1103-1110

[9]Darling CE, Jiang R, Maynard M,et al. Postconditioning via stuttering reperfusion limits myocardial infarct size in rabbit hearts: role of ERK1/2[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(4):1618-1626

[10]Sun HY, Wang NP, Halkos M, et al. Postconditioning attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibition of JNK and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways[J]. Apoptosis,2006,11(9):1583-1593

[11]Shao H, Li J, Zhou Y. Dose-dependent protective effect of propofol against mitochondrial dysfunction in ischaemic/reperfused rat heart: role of cardiolipin[J]. Br J Pharmacol,2008,153(8): 1641-1649

[12]He W, Zhang F J, Wang S P. Postconditioning of sevoflurane and propofol is associated with mitochondrial permeability transition pore[J]. J Zhejiang Univ Sci B,2008,9(2):100-108

(收稿日期：2015-12-05)

中圖分類號：R542.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0008-03

作者簡介：王坤(1979~)女，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，研究方向：心肌保護(hù)作用機(jī)制研究。

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳2012年度科學(xué)技術(shù)研究(面上)計(jì)劃項(xiàng)目，編號：12521189。