劉子明

(吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林 四平 136001)

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大孔吸附樹(shù)脂-HPLC-DAD法測(cè)定知黃湯中梓醇的含量①

劉子明

(吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林 四平 136001)

摘要:目的:建立大孔吸附樹(shù)脂-HPLC-DAD法測(cè)定知黃湯中梓醇含量的方法。方法:色譜柱為shim-pack VP-ODS C18(250mm×4.6mm,5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，流速1.0mL/min。結(jié)果:梓醇在0.88~8.8μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9996)，平均回收率為99.01%,RSD=0.3%(n=6)。結(jié)論:該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于本品的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:知黃湯；大孔吸附樹(shù)脂；HPLC；地黃；梓醇

知黃湯是由生地黃、知母、大棗、干姜等11味藥組成的復(fù)方制劑。具有清熱解毒，疏郁散瘀的功效，臨床上用于肝炎，肝硬化等疾病，療效顯著。生地黃為方中的君藥，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為生地具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效。而生地黃中的梓醇是它的主要有效成分之一[1]，有文獻(xiàn)報(bào)道用薄層掃描法、薄層掃描-比色法測(cè)定其含量[2]，也有用HPLC測(cè)定其含量。HPLC法具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等特點(diǎn)。本試驗(yàn)建立了大孔吸附樹(shù)脂-HPLC-DAD測(cè)定知黃湯中梓醇含量的方法，以便控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，為建立該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1儀器與試藥

1.1儀器

2010AHT全自動(dòng)高效液相色譜儀(日本島津)；CLASS-VP色譜工作站(日本島津)；二極管陣列檢測(cè)器(DAD)；FA1204B電子分析天平(d=0.1mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HS3120超聲波清洗儀(天津先德科技儀器有限公司)。

1.2試藥

知黃湯(實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)分別為：20140103 ；20140104；20140105)；梓醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110808-200508)；乙腈(色譜純，淄博迪敏德經(jīng)貿(mào)有限公司)；磷酸(分析純，北京化工廠)；二次蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)；D101大孔吸附樹(shù)脂(天津制膠廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1大孔吸附樹(shù)脂柱制備

取50g D101大孔吸附樹(shù)脂用乙醇浸泡7d，濕法裝色譜柱后，用乙醇洗脫，流出液與水不產(chǎn)生渾濁，改用蒸餾水洗脫，備用。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的梓醇對(duì)照品4.4mg，用流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)定容至10mL容量瓶中，制成每1mL含0.44mg的溶液，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

精密吸取知黃湯25mL，加于大孔吸附樹(shù)脂柱，然后用蒸餾水，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集20%~80%洗脫液，減壓濃縮到100mL，取濃縮液1mL稀釋定容至10mL量瓶，備用。精密量取稀釋液1mL，置10mL容量瓶中，加流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照液的制備

按處方取除去生地黃的其他各味中藥按知黃湯制備工藝制成陰性對(duì)照樣品，取陰性對(duì)照樣品適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照液。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：shim-pack VP-ODS C18(250mm×4.6mm,5μm，批號(hào)：3082427)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)，流速：1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20μL，在此色譜條件下測(cè)定，理論塔板數(shù)按梓醇峰計(jì)算不低于5000,分離度大于1.5。

分別取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示陰性對(duì)照液在梓醇相應(yīng)峰位置無(wú)任何峰出現(xiàn)，說(shuō)明該湯劑中其他成分對(duì)梓醇測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

A B C

圖1 高效液相色譜圖

注：1.梓醇峰；A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照品溶液

2.4線性關(guān)系考察

分別精密吸取梓醇對(duì)照品溶液2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，依法測(cè)定。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，梓醇對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y=226332x-115977,r=0.9996，表明，梓醇進(jìn)樣量在0.88~8.8μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取同一濃度對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果梓醇色譜峰面積的RSD為0.61(n=5)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)：20140103)5份，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，以上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果顯示梓醇含量的RSD為0.60(n=5)，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)：20140103)，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，按上述色譜條件，分別于0，4，8，12，16，24h進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，結(jié)果梓醇峰面積的RSD為1.18(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知梓醇含量的知黃湯(批號(hào)為20140103)25mL，共6份，分別精密加入梓醇對(duì)照品適量，按照2.2.2項(xiàng)下制備，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明，本法準(zhǔn)確可靠。見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.9樣品測(cè)定

取3批樣品，每批3份，每份1mL，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算含量，見(jiàn)表2。

表2　樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3討論

3.1該制劑由11味中藥組成，因此成分復(fù)雜，干擾大，主峰與雜質(zhì)峰分離效果不好，本試驗(yàn)采用了大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行了純化，結(jié)果梓醇分離效果較好,主峰與雜質(zhì)峰分離較好。

3.2本試驗(yàn)開(kāi)始參照文獻(xiàn)報(bào)道[3]，采用甲醇-0.1%磷酸溶液(1：99)為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰分離效果不好，峰形有拖尾。因此本文對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)組成與比例進(jìn)行比較。然后參照《中國(guó)藥典》[4],采用地黃中梓醇含量測(cè)定時(shí)的流動(dòng)相系統(tǒng)(乙腈-0.1%磷酸溶液(1：99)，結(jié)果表明，采用流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(1：99)能使梓醇標(biāo)準(zhǔn)品峰形良好無(wú)拖尾，且與其它組分達(dá)到較好分離。

參考文獻(xiàn):

[1]賀玉琢，李振東.日本對(duì)地黃的研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，1997，19(4)：13-17

[2]張玲，徐新剛.雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定生地及熟地中梓醇的含量[J].中草藥，1998，29(5)：308

[3]邱建國(guó),張汝學(xué),賈正平,等. HPLC法測(cè)定地黃、不同提取物及熟地黃中的梓醇[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,(1):23-25

[4]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：115-116

The determination of catalpol in Zhi-huang decoction by macroporous resin and HPLC-DAD

LIUZi-ming

(Jilin Engineering Vocational College, Siping 136001,China)

Abstract:Objective: To establish an macroporous resin and HPLC-DAD method of Determination capaltol in Zhi-huang decoction. Methods: The sample was separated on a Shimadzu VP-ODS (250mm×4.6mm,5 μm) with acetonitrile -0.1% Phosphoric acid(1：99). The detection wavelength was set at 210nm. The flow rate was 1.0mL/min. Result: The calibration curve was linear over the range of 0.88~8.8μg(r=0.9996). The average recovery of the method was 99.01%. The RSD of precision of the sample was 0.3%(n=6). Conclusion: The results showed that this method was rapid, simple, accurate and reliable, and it could be used for quality control of Zhi-huang decoction.

Key words:Zhi-huang decoction; macroporous resin; HPLC; rehmannia; catalpol

(收稿日期：2015-11-09)

中圖分類號(hào):R917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)01-0051-02

作者簡(jiǎn)介:劉子明(1979~)男,吉林公主嶺人，學(xué)士，講師，主要從事食品藥品分析及質(zhì)量控制研究。

基金項(xiàng)目：四平市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：2014045。.