王馳柳柯趙立東候琨施磊楊仕明寧博江蘇省徐州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科(江蘇009）解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所（北京0085）中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（沈陽000）

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老年性聾耳蝸帶狀突觸數(shù)量在時空上的改變

王馳1柳柯2趙立東2候琨2施磊3楊仕明2寧博1
1江蘇省徐州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科(江蘇221009）
2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所（北京100853）
3中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（沈陽110001）

【摘要】目的研究年齡相關(guān)性聽力損失過程中聽力閾值變化與耳蝸內(nèi)毛細胞帶狀突觸標記物數(shù)量之間的關(guān)系。方法應(yīng)用C57BL/6J小鼠進行本研究。在本研究中，對鼠齡為1、2、4、6和12個月的C57BL/6J小鼠分別進行ABR閾值檢測分析(Click & Tone burst)。對被檢測小鼠的耳蝸基底膜標本進行突觸前特異蛋白RIBEYE/CtBP2進行免疫熒光標記，采用激光共聚焦觀察結(jié)合三維重建的方法來計數(shù)突觸標記物(RIBEYE/CtBP2)的數(shù)量并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果小鼠的ABR閾值從鼠齡4個月時開始出現(xiàn)顯著抬高(P<0.05)，以后在鼠齡為6和12個月時抬高更加明顯。在頻率分布上，這種閾值的抬高在高頻區(qū)域(8KHz & 16KHz)表現(xiàn)的最為明顯。同時，本研究發(fā)現(xiàn)標記物的數(shù)量和ABR閾值的變化呈現(xiàn)一致性的改變：突觸標記物數(shù)量也在4個月時開始出現(xiàn)減少(P<0.05)，且隨著鼠齡的增加數(shù)量減少更加明顯。這種數(shù)量減少的表現(xiàn)在高頻區(qū)域(8KHz & 16KHz)表現(xiàn)得尤為顯著(P<0.01)。在聽力減退的早期階段(鼠齡4-6個月)，小鼠毛細胞，尤其是內(nèi)毛細胞數(shù)量并未現(xiàn)明顯的減少。結(jié)論老年性聽力損失和耳蝸帶狀突觸的數(shù)量改變密切相關(guān)，突觸數(shù)量的減少可能是導(dǎo)致年齡相關(guān)性聽力損失的一個重要因素。

【關(guān)鍵詞】老年性聾；C57小鼠；耳蝸帶狀突觸；RIBEYE/CtBP2；內(nèi)毛細胞；

對于這個突觸結(jié)構(gòu)在老年性聾發(fā)生、發(fā)展過程中是否發(fā)揮作用以及發(fā)揮何種作用的問題，長期以來一直鮮有報道。Stamatak等發(fā)現(xiàn)衰老過程中突觸后神經(jīng)末梢存在折疊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)似乎影響了動物的聽力水平[1]。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)小鼠的帶狀突觸數(shù)量在衰老過程中也發(fā)生了顯著變化，這種變化和聽力的變化之間存在一定的相關(guān)性。下面就將這方面的研究結(jié)果作系統(tǒng)性的報告。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

本實驗采用SPF級C57BL/6J (由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供)進行，共選取50只小鼠（100個耳蝸），入組要求ABR聽閾正常，排除中耳及內(nèi)耳疾病。動物隨機分為5組，每組10只。分別在鼠齡為1個月、2個月、4個月、6個月和12個月時對其聽力水平進行聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢測。本研究所有實驗操作均得到中國人民解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會的批準。

1.2聽功能測試

動物分別于鼠齡1M,2M,4M,6M和12M時行雙耳ABR閾值測試，采用美國TDT測聽設(shè)備，Biosig測聽軟件對小鼠進行ABR閾值檢測。實驗在隔聲屏蔽室內(nèi)進行，測聽前使用10%水合氯醛（4.5ml~5ml/Kg，腹腔注射）對小鼠進行麻醉。麻醉滿意后，將記錄電極置于小鼠兩側(cè)耳廓前緣連線中點皮下，參考電極置于測試耳耳垂，接地電極置于對側(cè)耳耳垂，測試耳機距外耳道口約0.5cm，檢測小鼠雙耳的ABR閾值。實驗采用短聲（Click）和短純音（Toneburst，Rise/Fall time:1 msec；Duration:4 msec）作為刺激聲，帶通濾波為300～3000 Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時間10ms。刺激強度自90dBL SPL開始，以10dBL逐漸遞減，直至檢測不出重復(fù)的ABR波形，再向上增強5dBL，直至能檢測出重復(fù)的ABR波形，此刺激聲強度即為小鼠的聽閾。

1.3耳蝸Corti器標本制備

頸椎脫臼法處死小鼠，迅速將其斷頭，快速取出耳蝸，將小鼠耳蝸放人盛有4%多聚甲醛溶液的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下，用細針在蝸頂鉆孔，并開放圓窗和卵圓窗。用4%多聚甲醛溶液自蝸頂進行灌流，沖出淋巴液。將已灌流的耳蝸標本置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定，4℃冰箱過夜。取出標本置于10%乙二胺四乙酸（EDTA，北京化工廠）溶液中脫鈣

在車間排放方面，目前的管理過于嚴格，相關(guān)部門要求，在汽車啟動狀態(tài)下，需要對汽車尾氣進行處理，但其實即使汽車不在修理廠內(nèi)，在路上行駛，尾氣排放也隨時都在發(fā)生。

1.4免疫熒光染色

將分離好的基底膜置于0.5%Triton X-100中30 min，PBS沖洗3次，含5%山羊血清、2% BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白)的PBS封閉液阻斷非特異性位點2 h，羊抗鼠Ctbp2 (E-16)抗體(1 :200,SANTA CRUZ) 4℃過夜，PBS沖洗3次；?？寡騃gG FITC(1:100,SANTA CRUZ)，37℃避光染色40min，PBS沖洗3次，蒸餾水沖洗1次。最后用Dapi染色液(SANTA CRUZ)避光染色15min，再用PBS溶液漂洗2遍，5min/遍。解剖顯微鏡下將基底膜標本平鋪于載玻片上，甘油封片。

1.5激光共聚焦顯微鏡成像及突觸標記物數(shù)量計數(shù)

激光共聚焦顯微鏡型號為：Leica TCS SP2 AOBS,激發(fā)光波長為488 nm和543 nm，100×油浸物鏡下觀察，并局部數(shù)字放大2倍。對所觀察區(qū)域的內(nèi)毛細胞進行序列掃描，掃描層距設(shè)定為0.2μm。本實驗中，被標記的突觸前特異蛋白RIBEYE/CtBP2因使用FITC而顯示綠色熒光.序列掃描始于熒光色對出現(xiàn),止于熒光色對消失。采集二維圖像,每一組序列圖像文件置于一個文件夾內(nèi),并按序號排列。對10條耳蝸基底膜的頂回進行序列掃描,每個基底膜掃描3個視野(頂、中、底各1個視野)，共生成10個序列文件。

1.6應(yīng)用3DS MAX進行三維建模

在3DS MAX 8中的頂視窗口中按序列掃描時由上至下的順序調(diào)入采集的二維圖像做為視口背景.先調(diào)入第一幅二維圖像,在出現(xiàn)綠色熒光的位置畫球體作為標記.再調(diào)入下一幅,如果出現(xiàn)綠色熒光的位置與上一幅相同,不做標記,認為是同一個突觸部位;如果在其他位置上出現(xiàn)綠色熒光,則表示在這一層面上有新的突觸出現(xiàn),再用球體做出標記.以此類推,最后得出這種突觸標記物數(shù)量。依次對各個序列文件中的每幅二維圖象中的熒光位置進行標記，最后完成對10個序列文件內(nèi)全部二維圖片的掃描和標記，剔除其中重復(fù)標記的熒光部位，之后對于所有被標記的綠色熒光球體進行數(shù)量計數(shù)，得出總計突觸標記物數(shù)量。突觸標記物總數(shù)除以綠色標記物所在區(qū)域中的全部內(nèi)毛細胞數(shù)量，即得到每個內(nèi)毛細胞上突觸標記物的數(shù)量(以均數(shù)±標準差顯示)。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗中，聽性腦干反應(yīng)(ABR)閾值和突觸標記物數(shù)量以均值±標準差(x±SD)表示，并采用one way ANOVA檢驗比較組間差異，兩兩比較等用SNK法。所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS18．0軟件統(tǒng)計，P < 0.05表明組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1衰老過程中的聽力損失

本研究中，首先檢測了C 57小鼠在衰老過程中聽力損失的情況。在本研究的Click檢測中，1月組小鼠為9.58±2.85，2月組小鼠為10.34±3.05，4月組小鼠為24.12±4.14，6個月組小鼠為37.65± 5.51，12個月小鼠組為72.18±6.80。組間差異分析顯示，1，2個月鼠齡組間無顯著性差異（圖1，P > 0.05）。然而對鼠齡為4，6，和12個月的閾值檢測卻顯示出了明顯不同的結(jié)果。閾值在4個月小鼠中出現(xiàn)顯著升高，在6個月和12個月小鼠中閾值繼續(xù)抬升，統(tǒng)計顯示，以上三組均與4月鼠齡之前各組存在顯著性差異(P < 0.05)。而且6，9和12月三組之間也存在顯著性差異(P < 0.05)。說明在衰老過程中，C57小鼠的ABR(Click)閾值是處于不斷升高的狀態(tài)下的。

圖1　鼠齡分別為1,2,4,6,和12個月C57小鼠的Click閾值Fig.1 ABR threshold (Click) at the age of 1,2,4,6,and12 months in C57BL/6J mice (Mean±SD)

同樣地，還比較了各頻率上不同鼠齡小鼠的聽力水平。發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠在鼠齡分別為1個月和2個月時，即使在不同頻率上也沒有表現(xiàn)出具有統(tǒng)計學(xué)意義的閾值變化（見表1）。而對于鼠齡分別為4個月、6個月和12個月的小鼠來說，tone brust的檢測結(jié)果則顯示出了明顯的變化：即越是處在高頻區(qū)域中（底回區(qū)域），小鼠聽力閾值抬升的幅度越大。比如在本研究中，6個月鼠齡的小鼠聽閾值分別為56.53±7.11 (8KHz)和66.34±8.36 ( 16KHz)。而12個月鼠齡小鼠分別為77.26±8.16 (8KHz)和81.44±9.22 (16KHz)，與2個月鼠齡組比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P < 0.001）。

表1　C57小鼠在衰老過程中聽力-頻率變化(均值±標準差)Tab.1 The alterations of hearing threshold across frequency in the duration of aging (Mean±SD)

More significant elevations of hearing threshold have been found at the region of high-frequency.The initial elevation has been identified at the mice of 4 months old.

2.2衰老過程中帶狀突觸數(shù)量的變化

為了探討聽力、頻率和帶狀突觸的突觸前標記物數(shù)量之間的變化關(guān)系，利用3D max軟件結(jié)合免疫熒光標記方法計數(shù)不同鼠齡C57小鼠耳蝸不同回段上的突觸前標記物數(shù)量（圖2，RYBEYE/CtBP2）。發(fā)現(xiàn)這個突觸前標記物的數(shù)量變化和小鼠ABR (tone brust)閾值的變化基本遵循一致的規(guī)律：即在大鼠齡小鼠耳蝸的高頻區(qū)域出現(xiàn)了標記物數(shù)量上的最顯著下降，而在低頻部位數(shù)量變化的幅度則要明顯平緩（圖2）。相比較而言，即使是較高鼠齡的小鼠，其低頻區(qū)域的突觸標記物數(shù)量變化也要相對和緩（圖2）。

圖2　C57小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞突觸前特異蛋白RIBEYE的免疫熒光標記.Fig.2 Immunostaining labeling for specific pre-synapse protein (RIBEYE) in the cochlear IHC ribbon synapses in C57BL/6J mice.

Upper panel shows immunostaining evidence for specific pre-synaptic protein (RIBEYE/CtBP2) in cochlear ribbon synapses below inner hair cells in the mice (2 months old),from left to right is apex,middle,and basal turn,no significant reduction of synaptic labeling has been found at this panel.Lower panel reveals immunostaining results in the older mice (6 months old),a significant loss of synaptic ribbons is identified at the basal turn.Blue indicates DAPI staining identifying neclui; Green spot indicates specific pre-synapse protein (RIBEYE),white arrow indicated.Scale bar=5um.

本研究中計數(shù)了鼠齡1個月到12個月各回段的突觸標記物數(shù)量，結(jié)果顯示在幼-青年小鼠中，其耳蝸內(nèi)毛細胞下的突觸標記物數(shù)量比較多，但是在鼠齡小于6個月時，各組小鼠的突觸標記物數(shù)量變化不明顯(P>0.05，表3)。隨著C57小鼠的鼠齡增大（> 6個月），突觸標記物數(shù)量出現(xiàn)了下降(P<0.05，表3)，到鼠齡為12個月大小時，突觸標記物數(shù)量的減少變得明顯(P<0.05，表3)，而且這種數(shù)量上的減少在底回（高頻區(qū)域）表現(xiàn)的更加顯著(P < 0.01，表3)。

表2　衰老過程中C57小鼠內(nèi)毛細胞帶狀突觸前標記物在各頻率上的數(shù)量分布(單位:每個內(nèi)毛細胞)Tab.2 The distributions of cochlear ribbon synapse across frequency in C57BL/6J mice during aging (per IHC).

There are no significant differences among the mice of 1,2,and 4 months age.The reduction of cochlear ribbon synapse has been firstly identified at the mice of 6 months age.Significant loss of ribbon synapses is found at the mice of 12 months age,P<0.05.The maximal reduction of cochlear ribbon synapses is identified at the region of basal turn compared with apex and middle turns,P<0.01.

3　討論

本研究結(jié)果表明，伴隨著小鼠的衰老過程，其ABR聽閾值也相應(yīng)地升高。而且，在耳蝸的高頻區(qū)域（8-16kHz），小鼠的聽閾值更是呈現(xiàn)出了快速抬升的趨勢。同樣，計數(shù)同一過程中的突觸前標記物數(shù)量(RIBEYE/CtBP2)，發(fā)現(xiàn)了和聽力變化呼應(yīng)的變化趨勢：即6個月之后的小鼠各個頻段上的標記物數(shù)量均出現(xiàn)了下降，在高頻區(qū)（8-16kHz）標記物數(shù)量下降得更加明顯。而且這種趨勢隨著鼠齡的增長變得越發(fā)明顯。

先前的研究都證實了隨著年齡的增長，小鼠內(nèi)外毛細胞都會出現(xiàn)缺失的情況，這種毛細胞數(shù)量上的缺失在外毛細胞上表現(xiàn)得更加明顯，相比較而言，內(nèi)毛細胞的缺失在高齡小鼠身上才會有明顯的表現(xiàn)[2,3,13]。但是事實上內(nèi)毛細胞下傳入神經(jīng)突觸的減少在小鼠相對比較年輕時就發(fā)生了，試驗的結(jié)果給這個結(jié)論提供了證據(jù)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毛細胞傳入神經(jīng)突觸對于耳毒性刺激十分敏感，這種敏感性顯著高于耳蝸其它部件，比如外毛細胞、內(nèi)毛細胞、螺旋神經(jīng)等結(jié)構(gòu)[9]。其他學(xué)者在噪聲環(huán)境下研究這個突觸結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)中等強度的噪聲可以引起暫時性聽閾變化，但是突觸的數(shù)量卻不能完全恢復(fù)[12,14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，不僅聽力的損害是可以恢復(fù)的，突觸標記物數(shù)量似乎也有完全的恢復(fù)[8]。兩種條件類似的實驗結(jié)果并不完全一致，可能的解釋目前主要來自于動物的區(qū)別，前者的實驗所應(yīng)有的動物為小鼠[12]，后者的動物為豚鼠[8]，同樣的聲音刺激在不同動物耳蝸當中所產(chǎn)生的影響可能存在差別。所使用的動物是具有年齡相關(guān)性特點的C57小鼠，突觸數(shù)量和空間分布上的變化主要反應(yīng)老年性聽力損害的一些特點。但是上述這些實驗結(jié)果至少有一個特點是共同的，即聽力損害性因素，不論是耳毒性暴露、噪聲性暴露、或者是衰老性因素，耳蝸內(nèi)毛細胞傳入神經(jīng)突觸都會首先感知上述因素的影響并最早做出適應(yīng)性改變。

目前同類研究中一個比較棘手的問題是還沒有一種有效的檢測方法，來評估各種狀態(tài)下耳蝸內(nèi)毛細胞傳入神經(jīng)突觸的功能。ABR檢測無疑不能準確反映這個突觸功能的情況，目前有些研究通過檢測CAP的方法來估計這個突觸的功能狀況[14,15,16]，但是這個電位實際上是聽神經(jīng)末梢和毛細胞之間的總和電位，這個電位并不能準確代表耳蝸內(nèi)毛細胞傳入神經(jīng)突觸的電位值。有學(xué)者通過檢測聽神經(jīng)束自發(fā)放電頻率來估計突觸的功能，具有一定的可操作性和合理性，但是仍然不是一種理想的檢測手段。未來的解決方法之一是對新生動物的基底膜標本進行培養(yǎng)[17]，待培養(yǎng)的標本狀態(tài)穩(wěn)定后檢測突觸后興奮電位或電流(EPSP&EPSC)，盡管有研究報道可以檢測到單個帶狀突觸的興奮性電位或電流[18,19,20]，然而我們在實際檢測中發(fā)現(xiàn)單個或少數(shù)突觸的電位值很小難以檢測。比較可行的方法是對多個內(nèi)毛細胞區(qū)域的突觸后興奮性后電位或電流值進行檢測，以得到這個區(qū)域的突觸后總和電位或電流值。通過設(shè)置相同數(shù)量內(nèi)毛細胞的對照區(qū)域，人為破壞內(nèi)毛細胞及突觸的方法來消除其它干擾因素，兩者相減得到比較準確的突觸后電位或電流數(shù)值。然而檢測活體動物的帶狀突觸功能目前看來依然是一個難以完成的任務(wù)，可能還需要進行長時間的探索或依賴于大的技術(shù)突破，就當前情況而言，通過分析ABR I波的潛伏期或幅值，或者通過分析CAP幅值依然是一個既可行又有效的功能性評估手段。

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·聽覺研究新模型專輯·

Time and frequency dependent changes of cochlear ribbon synapses in age-related hearing loss

WANG Chi1,LIU Ke2,HOU Kun2,SHI Lei3,YANG Shiming2,NIN Bo1
1Department of Otolaryngology Head and Neck surgery,Central Hospital of Xuzhou,Jiangsu Province,221009 2Department of Otolaryngology Head and Neck surgery,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853 3Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang,110001
Corresponding author:NING BoEmail:boxuzhou@126.com

【Abstract】Objective To study possible correlations between the number of cochlear ribbon synapses and elevation of ABR thresholds related to aging.Methods C57BL/6J mice were utilized to mimic age related hearing loss in this study.ABR threshold was examined at 1M,2M,4M,6M,and 12M respectively.Immunostaining combined with laser confocal microscopy was used to identify RIBEYE/CtBP2,a specific pre-synaptic component of cochlear ribbon synapses,and the number of labeling synaptic ribbons was calculated using the 3D max 8.0 software.Results ABR threshold elevation was first found after 4M (P<0.05),and continued to increase at 6M and 12M (P<0.05).Further,the most significant ABR threshold elevation at a given age was identified at high frequencies (P<0.01,8 and 16 kHz).Correspondingly,the reduction of labeling ribbon synapses was noticed along with ABR threshold shifts as the mice aged,also with more labeling synapses reduction in the high frequency regions (P<0.01,8 and 16 kHz).However,we did not find significant loss of inner hair cells in during the same aging period.Conclusion There is faithful correlation between hearing threshold shifts and reduction of labeling synaptic ribbons,with most reduction occurring in high frequency regions.This study shows that the loss of ribbon synapses may contribute to age-related hearing loss.

【Key words】Age-related hearing loss ; C57 mice; Cochlear ribbon synapse ; RIBEYE/CtBP2; Inner hair cell;

收稿日期：（2016-01-06）

通訊作者：寧博，Email :boxuzhou@126.com

作者簡介：王馳，研究生，主治醫(yī)師，研究方向：耳鼻咽喉基礎(chǔ)與臨床

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.007

【中圖分類號】R764.436

【文獻標識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）01-32-5