王厚磊　盧偉　李德芳　丁磊　吳靖平

(復旦大學附屬金山醫(yī)院骨科，上海　201508)

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·論著·

大鼠髓核細胞體外衰老模型的建立

王厚磊盧偉李德芳丁磊吳靖平

(復旦大學附屬金山醫(yī)院骨科，上海201508)

摘要目的： 建立大鼠椎間盤髓核細胞體外衰老模型。方法： 提取大鼠椎間盤髓核細胞，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為對照組；在對照組基礎(chǔ)上加入終濃度為100 μmol/L三丁基過氧化氫(t-BHP)培養(yǎng)2 h，構(gòu)建髓核細胞體外衰老模型(衰老模型組)。采用Western印跡法檢測兩組髓核細胞的衰老相關(guān)指標微囊蛋白-1(caveolin-1)、β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的表達量，同時采用CCK-8細胞增殖實驗檢測兩組的細胞活性。結(jié)果： 與對照組比較，t-BHP作用2 h后，衰老模型組caveolin-1、SA-β-gal表達量明顯升高，且髓核細胞增殖速率減慢，細胞活性明顯降低。結(jié)論： 采用t-BHP誘導的方法能成功構(gòu)建髓核細胞體外衰老模型，caveolin-1在此過程中誘發(fā)了髓核細胞的衰老。

關(guān)鍵詞髓核細胞；衰老；三丁基過氧化氫

Establishment of the Senescence Model of Rat Nucleus Pulposus Cell in VitroWANGHouleiLUWeiLIDefangDINGLeiWUJingpingDepartmentofOrthopedics,JinshanHospital，F(xiàn)udanUniversity,Shanghai201508,China

AbstractObjective： To establish a senescence model of rat intervertebral disc nucleus pulposus cells.Methods： The nucleus pulposus cells, which were extracted from rat intervertebral discs and cultured in complete medium, were set as control group. The senescence model of nucleus pulposus cells in vitro(senescence model group) was established by additional culture for two hours on the basis of control group, to which tert-butyl hydroperoxide(t-BHP) was added with a final concentration of 100 μmol/L. The expression levels of senescence associated indexes, such as caveolin-1 and beta-galactosidase (SA-β-gal), in two groups were assessed by Western blotting, while the cell viability in two groups was detected by Cell Counting Kit-8(CCK-8) proliferation assay.Results： After two hours of t-BHP function, the expression levels of caveolin-1and SA-β-gal in senescence model group were significantly higher than those in control group, while the nucleus pulposus cells proliferation was slower and the cell viability was much lower.Conclusions： The senescence model of nucleus pulposus cells in vitro can be established successfully with the induction of t-BHP, and caveolin-1 induces the senescence of nucleus pulposus cells during the process.

Key WordsNucleus pulposus cells;Senescence;Tert-butyl hydroperoxide

椎間盤退行性疾病是中老年人的常見病和多發(fā)病，椎間盤退變(intervertebral disc degeneration, IVDD)是其發(fā)生的前提條件和病理基礎(chǔ)。引起IVDD的因素包括家族遺傳史、高齡、衰老等。其中，髓核細胞的提前衰老與IVDD密切相關(guān)；衰老可導致髓核細胞功能下降、細胞外基質(zhì)合成不足，進而發(fā)生IVDD[1]。目前，IVDD的確切發(fā)病機制及病理變化過程仍不明確[2]。構(gòu)建理想的體外椎間盤細胞衰老模型對研究IVDD的發(fā)生機制、減緩或逆轉(zhuǎn)其發(fā)病過程具有重要意義。

1資料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器DMEM高糖型培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；三丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；微囊蛋白-1(caveolin-1)、β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的一抗、二抗購自美國CST公司；蛋白上樣緩沖液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購自美國Corning公司；發(fā)光液購自美國Millipore公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱超凈工作臺購自上海力申科學儀器有限公司。

1.1.2實驗動物清潔級SD大鼠10只，10周齡，雌雄各半，體質(zhì)量150～200 g，由上海市公共衛(wèi)生臨床中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2010—0024]。無菌手術(shù)在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物科學部屏障動物實驗設(shè)施[許可證號：SYXK(滬)2010—0098]中進行，并按實驗動物3R原則給予大鼠人道關(guān)懷。

1.2方法

1.2.1SD大鼠椎間盤髓核細胞的分離與培養(yǎng)經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后采用頸椎脫臼法處死，常規(guī)消毒，在無菌條件下取整個腰椎；在解剖顯微鏡下剝離椎間盤周圍筋膜和肌肉并顯露椎間盤，將脊柱標本用預先準備的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次；用尖刀片輕輕刮除椎間盤上層軟骨終板，顯露軟骨終板之間的膠凍樣組織后用細針輕輕將其挑出并放入盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剪為0.5 mm3左右的組織塊；1000 r/min離心5 min，用PBS沖洗3次，采用序貫消化法獲取髓核細胞；以約2×104的密度接種于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于CO2體積分數(shù)為5%、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行換液、傳代、鋪板，隨機進行實驗分組。

1.2.2建立椎間盤髓核細胞衰老模型對照組細胞在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下用髓核細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h；衰老模型組細胞在對照組基礎(chǔ)上加入終濃度為100 μmol/L的 t-BHP后培養(yǎng)2 h。兩組均再用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，然后檢測相關(guān)指標。

1.2.3Western印跡檢測caveolin-1、SA-β-gal表達量將衰老模型組和對照組培養(yǎng)72 h后，去除各孔培養(yǎng)基，用預冷PBS清洗1次；去除PBS后每孔加入RIPA裂解液80 μL并于冰上裂解30 min；混勻，收集裂解液，并于4℃以14 000 r/min離心20 min；取上清液，測定蛋白濃度。取50 μg蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸8 min，按常規(guī)方法進行Western印跡，caveolin-1一抗為1∶1000稀釋，SA-β-gal一抗為1∶2000稀釋，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4細胞增殖檢測收集處于對數(shù)增長期的髓核細胞，以4×103/孔的密度接種于96孔板，每組3個復孔，培養(yǎng)于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在第0 h、24 h、48 h、72 h檢測細胞活性。按照CCK-8試劑盒說明書操作步驟，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，混勻后于孵箱中孵育2 h，然后應(yīng)用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度值。實驗重復3次。

2結(jié)果

2.1衰老相關(guān)蛋白檢測以β-actin作為內(nèi)參，對衰老模型組和對照組進行衰老相關(guān)蛋白檢測。Western印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，衰老模型組caveolin-1、SA-β-gal表達均較高(P=0.001)，衰老模型組細胞衰化明顯。見圖1。

A:對照組；B:衰老模型組。以β-actin作為內(nèi)參

2.2細胞增殖檢測CCK-8檢測結(jié)果顯示：與對照組細胞相比，隨著培養(yǎng)時間的增加，衰老模型組細胞活性逐漸降低，說明髓核細胞經(jīng)t-BHP作用2 h后， 細胞活性受到抑制，在72 h時最為顯著，抑制率達52.3%(P=0.002)。見圖2。

圖2　髓核細胞增殖檢測

3討論

目前尚無有效的治療途徑可以緩解IVDD。近年來，從細胞分子水平研究IVDD的機制成為研究的焦點之一。本研究旨在建立髓核細胞衰老模型，以模擬椎間盤退變時的細胞分子學改變，明確其發(fā)病機制。

有研究[3-5]已證實，椎間盤髓核細胞的衰老程度與椎間盤退變等級正相關(guān)；通過計算髓核組織內(nèi)的衰老細胞率發(fā)現(xiàn)，退變程度為ThompsonⅣ級的椎間盤的衰老細胞率比ThompsonⅡ級的椎間盤高25%左右，而椎間盤細胞的衰老程度與椎間盤細胞活性負相關(guān)。有學者[6]指出，多種復雜因素的共同作用使髓核細胞逐步衰老，衰老的髓核細胞活性降低，蛋白多聚糖、Ⅱ型膠原等細胞外基質(zhì)合成不足，繼而發(fā)生IVDD。

目前，構(gòu)建細胞衰老模型的方法有很多，比較常見的有化學誘導法和物理誘導法。物理誘導主要為紫外線照射法[7]?；瘜W誘導法主要是向細胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入特定的化學物質(zhì)，如過氧化氫(H2O2)[8-9]、D-半乳糖[10]等。國外研究[11]指出，氧化應(yīng)激障礙是促進機體衰老的重要因素之一；機體內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)發(fā)生功能紊亂會導致體內(nèi)過多的活性氧或自由基產(chǎn)生，使細胞功能下降，引起細胞損傷及衰老。應(yīng)用t-BHP誘導細胞衰老是一種經(jīng)典的體外誘導細胞衰老的方法，能較好模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激障礙[12]。但此方法在誘導椎間盤髓核細胞建立衰老模型方面未見進一步的研究。

細胞衰老是各種應(yīng)激因素刺激正常細胞所造成的。目前將細胞衰老分為復制性衰老(replicative senescence，RS)和應(yīng)激誘導過早衰老(stress-induced premature senescence，SIPS)。隨著細胞分裂次數(shù)的增加，絕大多數(shù)細胞都會發(fā)生RS。伴隨著細胞有絲分裂，端粒會逐漸縮短，并最終引起細胞的衰老。與RS不同，SIPS是各種應(yīng)激因素導致細胞終止分裂。目前發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)細胞衰老的刺激信號主要通過p53-p21通路和p16-Rb通路發(fā)揮作用[13]。p53-p21-Rb 通路被認為是誘發(fā)細胞衰老的重要途徑。當外界刺激因素損傷細胞遺傳物質(zhì)時，p53可以激活部分負性調(diào)控基因，以此阻止細胞增殖。它可以終止G1、G2期細胞有絲分裂，也可以誘導細胞提前衰老。caveolin-1可通過p53-p21 通路使細胞分裂增殖的進程阻滯，發(fā)揮負性調(diào)控作用，進而誘導細胞衰老。國外研究[14-16]表明，caveolin-1對胞膜中的信號分子有負性調(diào)控作用，以此抑制細胞增殖，促使細胞衰老；當細胞內(nèi)caveolin-1過表達時，易發(fā)生早熟性衰老。有學者[17]發(fā)現(xiàn)，caveolin-1可通過p53-p21信號通路使小鼠成纖維細胞功能減退，細胞增殖減緩，呈現(xiàn)衰老細胞的形態(tài)。Bartholomew等[18]也發(fā)現(xiàn)，過氧化應(yīng)激障礙時，人成纖維細胞中caveolin-1能夠通過穩(wěn)定p53上調(diào)p21的表達，促使細胞提前進入衰老狀態(tài)。因此，caveolin-1上調(diào)是促使細胞衰老的重要因素。Heathfield 等[19]在研究caveolin-1與氧化應(yīng)激障礙導致衰老的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，從IVDD患者中分離提取的髓核組織中caveolin-1表達量明顯上升，說明氧化應(yīng)激障礙會上調(diào)caveolin-1的表達，進而使得髓核細胞提前衰老，進一步加劇IVDD。Heathfield等[19]研究干細胞時也發(fā)現(xiàn)，衰老的干細胞中caveolin-1的表達量明顯上升，并伴隨著部分衰老基因如p16INK4a、p21過度表達，證實了在衰老干細胞中caveolin-1可啟動部分衰老基因過表達而使干細胞分化潛能不斷降低。

本研究成功構(gòu)建了IVDD髓核細胞的體外衰老模型，從而可以很好地模擬體內(nèi)IVDD時髓核細胞所發(fā)生的分子學變化。Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，衰老模型組髓核細胞中caveolin-1、SA-β-gal表達明顯升高，細胞增殖活性顯著降低。caveolin-1與細胞老化關(guān)系密切。在整個衰老過程中，細胞膜上所接受的外界刺激類似一個開關(guān)，決定了細胞衰老的演變過程，而caveolin-1 甚至被認為是“衰老開關(guān)”的啟動器；當caveolin-1過多表達時，細胞內(nèi)肌動蛋白張力絲增加，拉動細胞膜，細胞形態(tài)變?yōu)楸馄綘畹木薮蠹毎?，進而細胞功能減退并呈現(xiàn)出衰老特征[20]。SA-β-gal活性能較好地顯示細胞溶酶體的生理狀態(tài)，被公認為是反映細胞衰老程度的重要檢測指標[21]。本研究表明，髓核細胞衰老時，SA-β-gal表達水平明顯升高。

目前，對于椎間盤退變的研究主要集中于軟骨終板及纖維環(huán)，而體外髓核細胞老化模型的建立鮮有報道。本研究采用t-BHP誘導建立髓核細胞衰老模型，便捷高效。本模型不但證實了衰老髓核細胞的存在，而且有助于解釋衰老髓核細胞內(nèi)不同衰老途徑是如何相互聯(lián)系的，并初步探討了髓核細胞的衰老機制，為進一步研究髓核細胞的衰老機制及干預措施奠定了基礎(chǔ)。

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中圖分類號R681.5+3

文獻標志碼A

通訊作者：吳靖平，E-mail: drwujp@126.com

基金項目：上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項目(編號：2012-341)