曾昆 杜道林 薛永來

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院 江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，鎮(zhèn)江 212013）

基于特異性生物識別分子的黃曲霉毒素快速分析方法研究進展

曾昆 杜道林 薛永來

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院 江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，鎮(zhèn)江 212013）

黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次級代謝產(chǎn)物，容易污染糧食作物及其制品，主要存在于發(fā)霉的糧食、豆類、堅果及與其相關(guān)食品中。黃曲霉毒素，具有極強的毒性和致癌性，尤其是黃曲霉毒素B1，是目前已發(fā)現(xiàn)的最強的天然致癌物質(zhì)，嚴(yán)重威脅人類健康。目前食品中黃曲霉毒素的檢測以高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等儀器分析方法為主，然而儀器分析方法具有設(shè)備昂貴、操作繁瑣、需要專業(yè)人員等不足。近年來以特異性生物分子（抗體、重組抗體、適配體等）識別黃曲霉毒素，并結(jié)合不同的信號報告分子，建立了一系列黃曲霉毒素分析方法，檢測快速、靈敏并易于操作，在食品安全領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。著重從黃曲霉毒素的生物識別分子和信號報告分子兩方面介紹目前黃曲霉毒素的快速檢測手段，并對其進行比較和評價，同時對黃曲霉毒素快速檢測方法的發(fā)展方向進行展望。

黃曲霉毒素；抗體；適配體；快速分析

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉菌（Aspergiuus flavus）和寄生曲霉菌（Aspergiuus parasiticus）產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的總稱［1］，主要存在于發(fā)霉的糧食、豆類和堅果等中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20多種。由于黃曲霉毒素在紫外燈照射下可以發(fā)出熒光，根據(jù)熒光顏色的不同，分為B（blue）和G（green）兩大類［2］。常見的污染農(nóng)產(chǎn)品的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素B1（aflatoxinB1，AFB1）、黃曲霉毒素B2 （aflatoxinB2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxinG1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxinG2，AFG2），以及代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1（aflatoxinM1，AFM1）、黃曲霉毒素M2（aflatoxinM2，AFM2），其中飼料中污染的黃曲霉毒素是AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，而AFM1和AFM2是哺乳動物食用了黃曲霉毒素污染的飼料所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，因此常見于牛奶中［3］。

黃曲霉毒素，尤其是AFB1，毒性極強，其毒性是氰化鉀的10倍，是砒霜的68倍［4］。同時，黃曲霉毒素還是目前發(fā)現(xiàn)的最強致癌物質(zhì)，其致癌力是奶油黃的900倍，是3，4-苯并芘誘發(fā)肝癌能力的4 000倍［5］，1993年，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃定為已知最強致癌化學(xué)物質(zhì)之一，即Ⅰ類致癌物質(zhì)［6，7］。世界上已有100多個國家制定了食品中黃曲霉毒素的檢測［8］。目前黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)主要有3大類，分別針對AFB1、AFM1以及黃曲霉毒素總（AFB1+AFB2+AFG1+AFG2）。對于AFB1，歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)為2 μg/kg，我國國標(biāo)（GB 2761-2011）規(guī)定AFB1的殘留限量為0.5 μg/kg（嬰幼兒食品）和5-20 μg/kg（糧食、豆類、堅果等）；對于AFM1，歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.05 μg/kg，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為0.5 μg/kg；歐盟規(guī)定黃曲霉毒素總量的標(biāo)準(zhǔn)為4 μg/kg，我國并沒有對黃曲霉總量作出規(guī)定。

黃曲霉毒素的分析方法主要有化學(xué)分析方法、儀器分析方法、免疫分析方法等。其中化學(xué)方法，如薄層層析法，盡管操作簡便，但由于其特異性差、靈敏度低等不足，近年來已較少應(yīng)用；以高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)為主的儀器分析方法，靈敏度高、特異性強，被列為我國的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18979-2003），然而該方法需要對樣本進行凈化，并且操作繁瑣，需要專業(yè)的人員，并不適用于現(xiàn)場快速檢測。以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫分析方法，因其操作簡便、靈敏度高、耗時短等優(yōu)點，在食品安全快速檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，具有與傳統(tǒng)抗體類似功能的其他特異性生物識別分子，如重組抗體、適配體等已被報道，并且借助免疫分析方法的模式，建立了一系列的快速、靈敏的分析方法，用于黃曲霉毒素快速檢測。為更加系統(tǒng)和全面地了解目前黃曲霉毒素快速分析方法的發(fā)展現(xiàn)狀，本文對目前報道的黃曲霉毒素特異性識別分子以及各種分析方法在黃曲霉毒素檢測方面的應(yīng)用進行綜述，并對該領(lǐng)域的發(fā)展方向提出展望。

1　黃曲霉毒素生物識別分子

生物識別分子是快速生物檢測方法建立的核心，特異性的抗體是目前快速分析方法中最為常用的識別分子。常規(guī)的抗體制備方法需要大量的實驗動物，并且免疫周期長，能夠較好識別小分子的抗體并不容易獲得。隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及材料科學(xué)的發(fā)展，與抗體具有類似功能的新型識別分子——重組抗體、核酸適配體、分子印跡等，被制備或合成，并引入到生物檢測領(lǐng)域。

1.1抗體

以抗原-抗體特異結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫分析方法，在快速檢測領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位。抗體的特性直接影響分析方法的性狀。當(dāng)前報道的識別黃曲霉素抗體包括特異性抗體和廣譜性抗體兩大類，前者僅識別單一目標(biāo)物，后者則可以結(jié)合結(jié)構(gòu)類似的一類化合物。

1.1.1特異性抗體 張道宏等（Zhang）［9］獲得一株特異識別AFB1的單克隆抗體3G1，親和力為1.8×10-8L/mol，IC50達到1.6 ng/mL，與AFB2、AFG1、AFG2的交叉反應(yīng)率分別為6.4％、＜0.02％和＜0.02％。管迪等［10］篩選到一株特異性識別AFM1的單克隆抗體2C9，親和力為1.74×10-9L/mol，在牛奶中IC50達到67 ng/L，與AFB1、AFB2、AFG1、AFG2無交叉反應(yīng)。Min等［11］制備了AFB1的單克隆抗體2C12，平衡解離常數(shù)（Equilibrium dissociation constants，Kd）為6.95×10-9mol，IC50達到8 ng/mL，與AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反應(yīng)率分別為1.5％、4％、0.1％和0.4％，與AFM2、赭曲霉毒素（ochratoxins，OTA）、伏馬毒素（fumon-isins，F(xiàn)MB1）、FMB2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素等的交叉反應(yīng)率均低于0.01％。

1.1.2廣譜性抗體 張道宏等［12］通過兩步法篩選到5株廣泛識別黃曲霉毒素的單克隆抗體，經(jīng)進一步驗證，其中1C11具有最高的靈敏度，對AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的IC50分別為1.2、1.3、2.2、18.0和13.2 pg/mL。李培武等（Li）［13］以AFG2作為競爭物，篩選到3株黃曲霉毒素廣譜性抗體，針對標(biāo)準(zhǔn)品AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和AFM1，8E11交叉反應(yīng)率分別為100％、20.9％、88.4％、78.1％和87.6％；8F6交叉反應(yīng)率分別為100％、103.8％、100.1％、47.0％和65.0％；10C9交叉反應(yīng)率分別為100％、93.6％、95.4％、65.2％和70.9％。且IC50在1.25-5.99 ng/mL。

Liu等［14］采用EDC法合成抗原AFB1-CMOBSA，制備兩株單克隆抗體3F6G11和9C7C11，對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均有較好的識別能力，采用直接競爭法鑒定，3F6G11對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為0.051、0.050、1.820 和1.270 ng/mL，9C7C11對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為0.045、0.057、2.530和2.120 ng/mL。Liu等［15］采用EDC法合成抗原AFB1-CMOBSA，免疫兔子，獲得AFB1多克隆抗體，經(jīng)直接ELISA方法鑒定該抗體對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為0.15、0.55、0.32和3.83 ng/mL。Wang等［16］合成AFM1-CMO-BSA完全抗原，免疫兔子獲得AFM1多克隆抗體，該抗體對AFM1和AFB1的IC50分別為0.014和0.02 ng/mL。

1.2重組抗體

1994年出現(xiàn)的基因工程抗體，可以根據(jù)研究的需要在基因水平對免疫球蛋白進行切割、拼接或修飾，進而通過體外表達方式產(chǎn)生重組抗體［17］。相對于傳統(tǒng)抗體，重組抗體具有庫容量大（＞106）、避免使用實驗動物、增加特異性和親和力等優(yōu)點，在快速診斷領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用［18］。

Moghaddam等［19］在噬菌體抗體庫中篩選到15株單鏈抗體（single-chain variable fragment，scFv），并對其中12株進行鑒定發(fā)現(xiàn)其中5株對AFB1有較好的識別能力，其中Afla-45對AFB1的親和力可達6×10-9L/mol。交叉反應(yīng)結(jié)合顯示，Afla-45對50 nmol/L AFG1也有較好的識別能力，但不能有效結(jié)合同樣濃度的AFM1、AFM2以及赭曲霉素。Min等［11］通過克隆其獲得的單克隆抗體2C12的可變區(qū)基因，篩選到識別AFB1的scFv，經(jīng)表面等離子體共振傳感器（surface plasmon resonance，SPR）檢測其Kd為1.16×10-7mol，比單克隆抗體2C12高出17倍，即scFv的親和力顯著低于單克隆抗體。作者認(rèn)為導(dǎo)致scFv親和力降低的原因在于scFv僅具有單一結(jié)合位點，而抗體分子具有兩個結(jié)合位點［20］。

除單獨表達重組抗體外，通過基因手段融合表達抗體-報告分子成為一種新興的研究手段。Rangnoi等［21］從人噬菌體抗體庫中篩選到特異性識別AFB1的scFv，并通過分子手段融合表達scFv-堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），經(jīng)ELISA鑒定，YM1-C3的融合蛋白scFv-AP的靈敏度要高于scFv（IC50分別為0.04和0.12 μg/mL），與AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反應(yīng)率分別為26.92％、70％、29.17％和0.88％。劉蓉等［22］將抗AFB1-scFv與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）通過linker連接，轉(zhuǎn)入不同的表達質(zhì)粒，構(gòu)建了8種重組質(zhì)粒，其中兩種pET32a-VH-GFP和pET32a-GFP-VH既有抗體活性，又有熒光活性，經(jīng)檢測，其抗體效價分別為0.92和0.506，純化后蛋白激發(fā)波長為488 nm，在495 nm處可發(fā)射出的熒光強度分別為1 554和661.5。

1.3核酸適配體（Aptamers）

核酸適配體是一類能夠以高特異性和靈敏度結(jié)合目標(biāo)分子的寡核苷酸（RNA或單鏈DNA）或短核酸鏈，通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）可以快速的從大容量的隨機單鏈核酸序列庫（1013-1015）中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體，靶物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、小分子有機物、金屬離子等［23］。對篩選到的適配體測序后，即可大量合成此識別分子。

Malhotra等［24］篩選到識別AFM1的aptamer 36株，Kd在35-1 515 nmol/L；識別AFB1 的aptamer 5株，Kd在96-221 nmol/L。通過Mfold software預(yù)測結(jié)構(gòu)，將36株識別AFM1 的aptamer分為8組，其中有6組具有保守的二級結(jié)構(gòu)，第7組aptamer能夠形成G-四鏈體，還有9株aptamer并沒有相似的結(jié)構(gòu)，被歸為第8組。有意思的是，親和力最高的aptamer AFAS3（Kd = 35 nmol/L）屬于第8組，具有兩個重疊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Ma等［25］篩選到9株識別AFB1的aptamer，Kd在11.39-93.24 nmol/L，其中3株aptamer（編號1、13和27）與AFB2、AFG1、AFG2、OTA和FB1的交叉反應(yīng)率＜15％。

2　信號報告分子

生物檢測技術(shù)發(fā)展至今，已相繼使用了多種標(biāo)記物，如放射性同位素、酶、熒光素等，這些標(biāo)記物的使用極大改善了分析方法的性狀。由于部分標(biāo)記方法復(fù)雜、標(biāo)記物昂貴等不足，近年來研究者探索了多種無標(biāo)記檢測方法，其中以傳感器應(yīng)用最為廣泛，通過物理、化學(xué)信號的改變實現(xiàn)分析物的定量/半定量檢測。

2.1酶催化底物

管迪等［10］應(yīng)用單克隆抗體2C9建立了AFM1 的ELISA方法，在牛奶中LOD為3 ng/L。Wang等［16］建立了直接競爭性ELISA方法，檢測AFM1的IC50為0.014 ng/mL。Rangnoi等［21］用融合蛋白scFv-AP建立了一步法AFB1檢測方法，檢測限為2.3 ng/mL，線性范圍2.3-5 000 ng/mL。

Fang等［26］以抗AFB1單克隆抗體包被微孔板，AFB1標(biāo)準(zhǔn)品或樣品和HRP-AFB1-BSA競爭性與抗體結(jié)合，以魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系作為檢測信號，AFB1檢測限為0.01 ng/g，線性范圍0.05-10 ng/g。

2.2熒光物質(zhì)

2.2.1熒光素 Shim等［27］以Cy5標(biāo)記DNA探針，和靶分子AFB1競爭性的與aptamer結(jié)合，建立了AFB1的試紙條分析方法，檢測限可達0.1 ng/mL，并用于谷物樣品檢測，靈敏度為0.3 ng/g。Ma等［25］以將AFB1 aptamer 結(jié)合在Fe3O4納米磁性顆粒上，用FAM標(biāo)記aptamer互補序列，建立了AFB1的磁珠分析方法。當(dāng)AFB1存在時，固化在磁珠上的aptamer優(yōu)先與AFB1結(jié)合，F(xiàn)AM標(biāo)記的互補序列存在于溶液中；當(dāng)AFB1不存在時，固化在磁珠上的aptamer則與互補序列結(jié)合。因此通過磁性分離，上清中的熒光強度與AFB1的濃度成正比。該方法的LOD為35 ng/L，線性范圍50-1 500 ng/L。Wang等［28］將6種毒素（AFB1、AFM1、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素和玉米赤霉烯酮）的完全抗原固化在瓊脂糖改性的載玻片，與游離抗原競爭性與相應(yīng)的抗體結(jié)合，通過Cy3標(biāo)記的二抗作為信號輸出方式。對AFB1和AFM1的檢測限分別為0.01 ng/mL 和0.24 ng/mL，線性范圍在0.04-1.69 ng/mL和0.45-3.9 ng/mL。李軍濤等［29］用FITC標(biāo)記AFB1單克隆抗體，建立了的免疫熒光層析試紙條法檢測食用油中的AFB1，檢測限為5 ng/mL。

2.2.2量子點 Zhang等［30］用CdTe量子點標(biāo)記AFB1單克隆抗體，建立的競爭性的免疫分析方法檢測限可達0.016 ng/mL，用于花生樣本檢測的IC50為0.149 ng/mL。許琳等［31］將碳量子點（Carbon quantum dots，CQD）探針和石墨烯量子點（graphene quantum dots，GQD）熒光免疫探針與AFB1單克隆抗體共價偶聯(lián)，表征后發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)后量子點均保持了較好的熒光特性，且與抗體偶聯(lián)后的碳量子點的熒光特性優(yōu)于石墨烯量子點，為量子點探針在AFB1檢測中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。Xu等［32］以紅色量子點（發(fā)射波長620 nm）標(biāo)記AFB1單克隆抗體，綠色量子點（發(fā)射波長620 nm）標(biāo)記半抗原，建立了一種均相熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測方法，對AFB1的檢測限為0.04 ng/mL，線性范圍0.06-5 ng/mL。

2.2.3其他熒光顆粒 Wu等［33］在磁珠表面偶聯(lián)AFB1-BSA和OTA-BSA，并以在上轉(zhuǎn)換納米顆粒NaY0.78F4：Yb0.2，Tm0.02 和NaY0.28F4：Yb0.7，Er0.02分別修飾抗AFB1和抗OTA單克隆抗體，建立了多標(biāo)記AFB1和OTA檢測方法，其中AFB1檢測限為0.01 ng/mL，線性范圍0.01-10 ng/mL。Liu等［34］用熒光微球標(biāo)記AFB1單克隆抗體，建立了可視化的免疫層析檢測方法，檢測限可達2.5 ng/mL。張兆威等［35］將黃曲霉毒素抗體與乳膠銪進行偶聯(lián)標(biāo)記，建立了時間分辨熒光免疫層析試紙條對AFB1進行檢測，對花生、稻米、植物油等農(nóng)產(chǎn)品的檢測限均為0.3 ng/g，線性范圍分別為0.8-25、0.8-15和0.8-30 ng/g。

2.3傳感器

傳感器技術(shù)涉及化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)及電子學(xué)等多個領(lǐng)域，在臨床醫(yī)藥、食品檢驗和環(huán)境保護等領(lǐng)域廣為應(yīng)用，其中電化學(xué)傳感器是其中重要的一類。電化學(xué)傳感器價格低廉，攜帶方便，便于操作，增強了傳統(tǒng)的分析方法的性能。

2.3.1電流型電化學(xué)傳感器 Paniel等［36］將AFM1抗體固化在超順磁性納米粒子上，進而通過磁性裝置將包被后的磁性納米顆粒組裝在碳電極表面，AFM1以及AFM1-HRP的競爭性與AFM1抗體結(jié)合，構(gòu)建的電化學(xué)傳感器LOD為0.01 ng/mL，線性范圍0.01-0.25 ng/mL。Parker等［37］采用標(biāo)準(zhǔn)的光刻方法將包含有35個微方電極的金微陣列以及對照電極和計數(shù)電極共同組裝在芯片上，AFM1抗體固化在微電極上，建立了AFM1電化學(xué)芯片檢測方法，在牛奶中檢測限為8 ng/L，線性范圍10-100 ng/L。Nguyen等［38］在叉指電極上修飾了聚合的四氧化三鐵/聚苯胺薄膜，并通過戊二醛將AFM1 aptamer作為捕獲原件固化在電極上，構(gòu)建了AFM1電化學(xué)檢測方法，檢測限為1.98 ng/L，線性范圍6-60 ng/L。

Lin等［39］用具有電活性的硫堇分子修飾中孔碳納米顆粒，進而用戊二醛法將AFB1多克隆抗體偶聯(lián)在中孔碳上，在玻璃電極表面修飾全氟磺酸膜。全氟磺酸膜帶負(fù)電荷，偶聯(lián)有抗體分子的納米顆粒帶正電荷，后者通過靜電作用結(jié)合到電極上，隨后納米顆粒上攜帶的硫堇誘發(fā)陰極電流產(chǎn)生電化學(xué)信號，當(dāng)有AFB1存在時，AFB1與其抗體特異性結(jié)合，誘導(dǎo)中孔碳納米顆粒從電極表面解離，從而減弱了硫堇誘發(fā)的陰極電流，導(dǎo)致電化學(xué)信號變化。經(jīng)過優(yōu)化后該方法的檢測限可達到3.0 pg/mL。Zhang等［40］在玻碳電極表面修飾單壁碳納米管/甲殼素（singlewalled carbon nanotubes/ chitosan，SWNTs/CS），通過EDC法將AFB1-BSA固化在電極表面，AFB1和AFB1-BSA競爭性的與抗體結(jié)合，堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗與特異性抗體結(jié)合，堿性磷酸酶催化底物萘磷酸鹽水解獲得電化學(xué)信號。該方法檢測限為3.5 pg/mL，線性范圍0.01-100 ng/mL。Singh等［41］在氧化銦錫（indium tin oxide，ITO）玻璃電極表面修飾了羧基化的多壁碳納米管（carboxylated multiwalled carbon nanotubes，c-MWCNTs），通過c-MWCNTs上的羧基將AFB1抗體組裝在電極表面，構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)傳感器用于AFB1檢測。該方法最低檢測限為0.08 ng/mL，線性范圍0.25-1.375 ng/mL。

2.3.2阻抗型電化學(xué)傳感器 孫蘭秀等［42］采用溶膠凝膠法將AFB1抗體組裝在玻碳電極表面，構(gòu)建了電化學(xué)阻抗傳感器，用于AFB1的檢測，該方法對AFB1響應(yīng)的線性范圍為1.0-10 μg/L，檢測限為0.1 μg/L。Li等［43］在玻碳電極上修飾了硅膠離子液體，為AFB1抗體固化提供了生物相容的微環(huán)境，建立了無標(biāo)記的電化學(xué)阻抗免疫傳感器方法，最低檢測限為0.01 ng/mL，線性范圍0.1-10 ng/mL。Yu等［44］在玻碳電極表面修飾碳納米管/離子液體/抗體（MWCNTs/ionic liquid/Ab），采用電化學(xué)阻抗法檢測AFB1，該方法檢測限為0.03 ng/mL，線性范圍0.1-10 ng/mL。Wang等［45］在電極表面修飾PPy/PPa/rGO （polypyrrole/Pyrrolepropylic acid/ grapheme oxide）膜，并將AFB1抗體組裝在膜上，構(gòu)建了一種新型的阻抗傳感器，該方法檢測限為10 fg/mL，線性范圍10 fg/mL-10 pg/mL。Castillo等［46］在金電極表面修飾了Poly（amidoamine）dendrimers（PAMAM G4），通過戊二醛定向固化AFB1 aptamer，通過循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜采集電化學(xué)信號，線性范圍0.1-10 nmol/L。

Bacher等［47］在銀線的表面組裝特異性的AFM1單克隆抗體，通過阻抗的變化來監(jiān)測AFM1與其特異抗體的結(jié)合，最低檢測限為1 pg/mL，線性范圍6.25-100 pg/mL。

2.3.3其他傳感器 Rameil等［48］采用3-（4-hydroxyphenyl）propionic acid（p-HPPA）作為電子供體，構(gòu)建了一種電位免疫傳感器，其信號強度顯著高于常規(guī)使用的電子供體（ABTS、OPD、TMB），并用于AFM1的檢測，檢測限為40 pg/mL，線性范圍250-2 000 pg/mL。Lv等［49］在玻碳電極表面修飾了中孔碳/Ag納米顆粒，并通過銀離子上的氨基將魯米諾和AFB1抗體組裝在電極上，建立了一種電化學(xué)發(fā)光傳感器，該方法檢測限為50 fg/mL，線性范圍0.1 pg/mL-50 ng/mL。Chauhan等［50］在金表面組裝一層4-ATP，采用EDC法將AFB1抗體共價偶聯(lián)在電極上，構(gòu)建了一種無標(biāo)記的電化學(xué)石英晶體微天平傳感器，該方法檢測限為0.1 ng/mL，線性范圍0.1-4 ng/mL。Park等［51］通過分子生物學(xué)技術(shù)，將特異性與金結(jié)合的金結(jié)合蛋白（gold binding protein，GBP）和特異性與抗體結(jié)合的protein G融合表達，利用獲得的融合蛋白GBP-ProG將AFB1抗體定向固化在傳感器金膜的表面，采用SPR方法檢測AFB1，檢測限為1 μg/mL。Jin等［52］將BSA-AFB1固化在電極表面，游離的AFB1和BSA-AFB1與競爭性的與AFB1抗體結(jié)合，通過與偶聯(lián)納米金作為重量標(biāo)簽的二抗結(jié)合，誘發(fā)質(zhì)量變化產(chǎn)生信號，構(gòu)建了壓電免疫傳感器。該方法檢測限為0.01 ng/mL，線性范圍0.1-100 ng/mL。

2.4基于金顆粒的檢測方法

以納米金顆粒為信號、硝酸纖維素膜為固相載體的側(cè)流層析方法或斑點免疫滲濾法，具有操作簡便、快速、無需儀器設(shè)備、經(jīng)濟等優(yōu)點，在快速分析領(lǐng)域占有重要位置。以抗體標(biāo)記金顆粒，構(gòu)建免疫層析分析方法，對AFB1或AFM1檢測限可達1.0 ng/mL［9，14-16］；以斑點免疫滲濾法檢測AFB1，可視化檢測限可達2 ng/mL［53］。同時，在此基礎(chǔ)上引入富集材料，可顯著提高方法的檢測限。黃艷梅等［54］采用包被有AFM1抗體的磁珠對樣本中目標(biāo)物進行富集，磁分離后的重懸液用于免疫層析試紙條檢測，對于原料乳中AFM1的檢測限可達0.1 ng/mL。

通過采用廣譜性抗體或是多通道檢測模式，實現(xiàn)了黃曲霉毒素多殘留檢測。張道宏等［55］應(yīng)用廣譜性抗體1C11建立了免疫層析分析方法，對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的檢測限可達0.03、0.06、0.12 和0.25 ng/mL。張道宏等［56］在常規(guī)的測流層析方法基礎(chǔ)上，建立了一種基于顏色變化的半定量的可視化檢測方法。在檢測區(qū)，采用了多條檢測線，并對其數(shù)目、間距、包被濃度以及噴射速率進行優(yōu)化，最終優(yōu)化后以3條檢測線的模式實現(xiàn)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的半定量檢測，檢測限分別為0.06、0.25、0.125和0.25 ng/mL。

基于金顆粒的物理性狀變化的新型分析方法，近年來也有所發(fā)展。Xu等［57］將AFB1-BSA偶聯(lián)在金納米棒上（gold nanorods，GNRs），當(dāng)溶液中沒有靶分子AFB1時，游離的AFB1抗體與AFB1-BSA結(jié)合后，誘發(fā)GNRs聚集，而當(dāng)溶液中存在AFB1時，AFB1抗體與溶液中的AFB1結(jié)合，無法結(jié)合到GNRs，因此GNRs保持分散狀態(tài)。通過檢測溶液的吸光度，構(gòu)建了一種簡單、快速的AFB1檢測方法。該方法檢測限為0.16 ng/mL，線性范圍0.5-20 ng/mL。Malhotra等［24］以AFM1 aptamer 建立了基于金顆粒的可視分析方法，當(dāng)AFM1含量超過250 nmol/L時可以觀察到顏色的變化。

2.5其他

Hu等［58］合成了一種蒙脫石-聚丙烯酰胺納米復(fù)合膜，吸附到復(fù)合膜上的AFB1的熒光強度與其在溶液中的濃度成正比，方法線性范圍為50-1000 ng/mL，最低檢測限9.72 ng/mL。Larou等［59］利用電穿孔儀將AFM1單克隆抗體插入Vero細(xì)胞的細(xì)胞膜中，當(dāng)溶液中的靶物質(zhì)與其抗體結(jié)合后，誘發(fā)細(xì)胞膜電位的變化，從而實現(xiàn)了AFM1的快速檢測，該方法檢測限可達5 pg/mL。

3　結(jié)語

黃曲霉毒素是一種高毒性的真菌毒素，可以污染許多重要的作物而進入到各種食物中，對人類健康產(chǎn)生重大威脅。以特異性的識別分子為基礎(chǔ)的生物分析方法在黃曲霉毒素的檢測中占據(jù)重要地位。特異性抗體是應(yīng)用最為廣泛的識別分子，近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸適配體、重組抗體等新興的識別分子被引入到快速分析領(lǐng)域，豐富了檢測方法的種類，并為檢測方法性狀的改進提供了新的途徑，但是由于穩(wěn)定性不夠、靈敏度不高等不足，以抗體為基礎(chǔ)的分析方法仍然占據(jù)主導(dǎo)地位。在常規(guī)的ELISA方法基礎(chǔ)上，新型標(biāo)記物（熒光素、納米顆粒等）的使用提高了檢測方法的靈敏度；傳感器技術(shù)，尤其是電化學(xué)傳感器，與一些新型納米材料，如多孔材料、碳納米管、石墨烯等相結(jié)合，發(fā)展出了許多新型的電化學(xué)傳感器，極大地提高了檢測方法的靈敏度，從ng水平提高到fg水平。但是電化學(xué)傳感器也有一定的局限性，如樣品中存在電活性物質(zhì)的干擾，長期的穩(wěn)定性較差等。

各國對食品安全愈加重視，食品安全標(biāo)準(zhǔn)也會越來越嚴(yán)格，對檢測方法的要求趨向高靈敏度、樣品前處理簡單、使用方便、穩(wěn)定性好等。探索多種穩(wěn)定性好、靈敏度高的識別分子、新型納米材料的引入以及加強傳感器技術(shù)的工業(yè)化、規(guī)?；榷喾N手段相結(jié)合，將會促進黃曲霉毒素檢測向著便攜化、操作簡便、低成本、產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展。

［1］ Ardic M， Karakaya Y， Atasever M， et al. Determination of aflatoxin B 1 levels in deep-red ground pepper（isot）using immunoaffinity column combined with ELISA［J］. Food and Chemical Toxicology，2008， 46（5）：1596-1599.

［2］ Detroy RW， Microbial Toxins［M］. New York：Academic Press，1971：163-178.

［3］ Han Z， Zheng Y， Luan L， et al. An ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of aflatoxins B1， B2， G1， G2， M1 and M2 in traditional Chinese medicines［J］. Analytica Chimica Acta， 2010， 664（2）：165-171.

［4］ Li P， Zhang Q， Zhang W. Immunoassays for aflatoxins［J］. TrAC Trends in Analytical Chemistry， 2009， 28（9）：1115-1126.

［5］ 李書國， 陳輝， 李雪梅， 等. 糧油食品中黃曲霉毒素檢測方法綜述［J］. 糧油食品科技， 2009， 17（2）：62-65.

［6］ Cavaliere C， Foglia P， Guarino C， et al. A sensitive confirmatory method for aflatoxins in maize based on liquid chromatography/ electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］. Rapid Communications in Mass Spectrometry， 2007， 21（4）：550-556.

［7］ Ventura M， Gomez A， Anaya I， et al. Determination of aflatoxins B1，G1， B2 and G2 in medicinal herbs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2004， 1048 （1）：25-29.

［8］ Van Egmond HP， Schothorst RC， Jonker MA. Regulations relating to mycotoxins in food［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007， 389（1）：147-157.

［9］ Zhang D， Li P， Yang Y， et al. A high selective immunochromatographic assay for rapid detection of aflatoxin B 1［J］. Talanta， 2011， 85 （1）：736-742.

［10］ Guan D， Li P， Zhang Q， et al. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based competitive enzyme immunoassay for aflatoxin M 1 in milk and infant milk products［J］. Food Chemistry， 2011， 125 （4）：1359-1364.

［11］ Min WK， Kweon DH， Park K， et al. Characterisation of monoclonal antibody against aflatoxin B 1 produced in hybridoma 2C12 and its single-chain variable fragment expressed in recombinant Escherichia coli［J］. Food Chemistry， 2011， 126（3）：1316-1323.

［12］ Zhang D， Li P， Zhang Q， et al. Production of ultrasensitive generic monoclonal antibodies against major aflatoxins using a modified two-step screening procedure［J］. Analytica Chimica Acta， 2009，636（1）：63-69.

［13］ Li P， Zhang Q， Zhang W， et al. Development of a class-specific monoclonal antibody-based ELISA for aflatoxins in peanut［J］. Food Chemistry， 2009， 115（1）：313-317.

［14］ Liu JW， Lu CC， Liu BH， et al. Development of novel monoclonal antibodies-based ultrasensitive enzyme-linked immunosorbent assay and rapid immunochromatographic strip for aflatoxin B1 detection［J］. Food Control， 2016， 59：700-707.

［15］ Liu BH， Hsu YT， Lu CC， et al. Detecting aflatoxin B1 in foods and feeds by using sensitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic strip［J］. Food Control， 2013， 30（1）：184-189.

［16］ Wang JJ， Liu BH， Hsu YT， et al. Sensitive competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic strip for detecting aflatoxin M1 in milk［J］. Food Control， 2011， 22（6）：964-969.

［17］ 何小鵑， 李官成. 腫瘤基因工程抗體研究進展［J］. 國外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊， 2002， 29（4）：245-248.

［18］ De Bruin R， Spelt K， Mol J， et al. Selection of high-affinity phage antibodies from phage display libraries［J］. Nature Biotechnology， 1999， 17：397-399.

［19］ Moghaddam A， L?bersli I， Gebhardt K， et al. Selection and characterisation of recombinant single-chain antibodies to the hapten Aflatoxin-B1 from naive recombinant antibody libraries［J］. Journal of Immunological Methods， 2001， 254（1）：169-181.

［20］ Shaw DM， Embleton MJ， Westwater C， et al. Isolation of a high affinity scFv from a monoclonal antibody recognising the oncofoetal antigen 5T4［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-General Subjects， 2000， 1524（2）：238-246.

［21］ Rangnoi K， Jaruseranee N， O'Kennedy R， et al. One-step detection of aflatoxin-B1 using scFv-alkaline phosphatasefusion selected from human phage display antibody library［J］.Molecular Biotechnology， 2011， 49（3）：240-249.

［22］ 劉蓉. 抗黃曲霉毒素 B-1 熒光重組抗體的制備［D］. 無錫：江南大學(xué)， 2010.

［23］ Stoltenburg R， Reinemann C， Strehlitz B. SELEX-a（r）evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands［J］. Biomolecular Engineering， 2007， 24（4）：381-403.

［24］ Malhotra S， Pandey AK， Rajput YS， et al. Selection of aptamers for aflatoxin M1 and their characterization［J］. Journal of Molecular Recognition， 2014， 27（8）：493-500.

［25］ Ma X， Wang W， Chen X， et al. Selection， identification， and application of Aflatoxin B1 aptamer［J］. European Food Research and Technology， 2014， 238（6）：919-925.

［26］ Fang L， Chen H， Ying X， et al. Micro-plate chemiluminescence enzyme immunoassay for aflatoxin B1 in agricultural products［J］. Talanta， 2011， 84（1）：216-222.

［27］ Shim WB， Kim MJ， Mun H， et al. An aptamer-based dipstick assay for the rapid and simple detection of aflatoxin B1［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2014， 62：288-294.

［28］ Wang Y， Liu N， Ning B， et al. Simultaneous and rapid detection of six different mycotoxins using an immunochip［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2012， 34（1）：44-50.

［29］ 李軍濤， 候水平， 姬澤薇， 等. 免疫熒光層析試紙條法檢測食用油中的黃曲霉毒素 B-1［J］. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2015， 7：17.

［30］ Zhang Z， Li Y， Li P， et al. Monoclonal antibody-quantum dots CdTe conjugate-based fluoroimmunoassay for the determination of aflatoxin B 1 in peanuts［J］. Food Chemistry， 2014， 146：314-319.

［31］ 許琳， 張兆威， 李培武， 等. 量子點探針應(yīng)用于糧油中黃曲霉毒素免疫檢測的研究［J］. 中國油料作物學(xué)報， 2015， 37（1）：119.

［32］ Xu W， Xiong Y， Lai W， et al. A homogeneous immunosensor for AFB 1 detection based on FRET between different-sized quantum dots［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2014， 56：144-150.

［33］ Wu S， Duan N， Zhu C， et al. Magnetic nanobead-based immunoassay for the simultaneous detection of aflatoxin B 1 and ochratoxin A using upconversion nanoparticles as multicolor labels［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2011， 30（1）：35-42.

［34］ Liu D， Huang Y， Chen M， et al. Rapid detection method for aflatoxin B 1 in soybean sauce based on fluorescent microspheres probe［J］. Food Control， 2015， 50：659-662.

［35］ 張兆威， 李培武， 張奇， 等. 農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的時間分辨熒光免疫層析快速檢測技術(shù)研究［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014，47（18）：3668-3674.

［36］ Paniel N， Radoi A， Marty JL. Development of an electrochemical biosensor for the detection of aflatoxin M1 in milk［J］. Sensors，2010， 10（10）：9439-9448.

［37］ Parker CO， Lanyon YH， Manning M， et al. Electrochemical immunochip sensor for aflatoxin M1 detection［J］. Analytical Chemistry， 2009， 81（13）：5291-5298.

［38］ Nguyen BH， Dai Tran L， Do QP， et al. Label-free detection of aflatoxin M1 with electrochemical Fe3O4/polyaniline-based aptasensor［J］. Materials Science and Engineering：C， 2013， 33 （4）：2229-2234.

［39］ Lin Y， Lin Y， Tang D， et al. Simple and sensitive detection of aflatoxin B 1 within five minute using a non-conventional competitive immunosensing mode［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2015， 74：680-686.

［40］ Zhang X， Li CR， Wang WC， et al. A novel electrochemical immunosensor for highly sensitive detection of aflatoxin B 1 in corn using single-walled carbon nanotubes/chitosan［J］. Food Chemistry， 2016， 192：197-202.

［41］ Singh C， Srivastava S， Ali MA， et al. Carboxylated multiwalled carbon nanotubes based biosensor for aflatoxin detection［J］. Sensors and Actuators B：Chemical， 2013， 185：258-264.

［42］ 孫秀蘭， 汪忠云， 方銀軍， 等. 溶膠凝膠法固定抗體制備黃曲霉毒素免疫傳感器［J］. 分析化學(xué)， 2010（2）：245-248.

［43］ Li ZJ， Zhongyun W， Xiulan S， et al. A sensitive and highly stable electrochemical impedance immunosensor based on the formation of silica gel-ionic liquid biocompatible film on the glassy carbon electrode for the determination of aflatoxin B 1 in bee pollen［J］. Talanta， 2010， 80（5）：1632-1637.

［44］ Yu L， Zhang Y， Hu C， et al. Highly sensitive electrochemical impedance spectroscopy immunosensor for the detection of AFB 1 in olive oil［J］. Food Chemistry， 2015， 176：22-26.

［45］ Wang D， Hu W， Xiong Y， et al. Multifunctionalized reduced graphene oxide-doped polypyrrole/pyrrolepropylic acid nanocomposite impedimetric immunosensor to ultra-sensitively detect small molecular aflatoxin B 1［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2015， 63：185-189.

［46］ Castillo G， Spinella K， Poturnayová A， et al. Detection of aflatoxin B 1 by aptamer-based biosensor using PAMAM dendrimers as immobilization platform［J］. Food Control， 2015， 52：9-18.

［47］ Bacher G， Pal S， Kanungo L， et al. A label-free silver wire based impedimetric immunosensor for detection of aflatoxin M1 in milk［J］. Sensors and Actuators B：Chemical， 2012， 168：223-230.

［48］ Rameil S， Schubert P， Grundmann P， et al. Use of 3-（4-hydroxyphenyl）propionic acid as electron donating compound in a potentiometric aflatoxin M 1-immunosensor［J］. Analytica Chimica Acta， 2010， 661（1）：122-127.

［49］ Lv X， Li Y， Cao W， et al. A label-free electrochemiluminescence immunosensor based on silver nanoparticle hybridized mesoporous carbon for the detection of Aflatoxin B 1［J］. Sensors and Actuators B：Chemical， 2014， 202：53-59.

［50］ Chauhan R， Solanki PR， Singh J， et al. A novel electrochemical piezoelectric label free immunosensor for aflatoxin B1 detection in groundnut［J］. Food Control， 2015， 52：60-70.

［51］ Park JH， Kim YP， Kim IH， et al. Rapid detection of aflatoxin B 1 by a bifunctional protein crosslinker-based surface plasmon resonance biosensor［J］. Food Control， 2014， 36（1）：183-190.

［52］ Jin X， Jin X， Chen L， et al. Piezoelectric immunosensor with gold nanoparticles enhanced competitive immunoreaction technique for quantification of aflatoxin B 1［J］. Biosensors and Bioelectronics，2009， 24（8）：2580-2585.

［53］ Ye Y， Zhou Y， Mo Z， et al. Rapid detection of aflatoxin B 1 on membrane by dot-immunogold filtration assay［J］. Talanta， 2010， 81（3）：792-798.

［54］ 黃艷梅， 劉道峰， 賴衛(wèi)華， 等. 集成免疫磁珠富集和免疫層析的黃曲霉毒素 M1 快速檢測法［J］. 分析化學(xué)， 2014， 42（5）：654-659.

［55］ Zhang D， Li P， Zhang Q， et al. Ultrasensitive nanogold probe-based immunochromatographic assay for simultaneous detection of total aflatoxins in peanuts［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2011，26（6）：2877-2882.

［56］ Zhang D， Li P， Liu W， et al. Development of a detector-free semiquantitative immunochromatographic assay with major aflatoxins as target analytes［J］. Sensors and Actuators B：Chemical， 2013， 185：432-437.

［57］ Xu X， Liu X， Li Y， et al. A simple and rapid optical biosensor for detection of aflatoxin B1 based on competitive dispersion of gold nanorods［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2013， 47：361-367.

［58］ Hu H， Garcia-Uribe A， Deng Y， et al. Layer-by-layer assembled smectite-polymer nanocomposite film for rapid fluorometric detection of aflatoxin B 1［J］. Sensors and Actuators B：Chemical， 2012， 166：205-211.

［59］ Larou E， Yiakoumettis I， Kaltsas G， et al. High throughput cellular biosensor for the ultra-sensitive， ultra-rapid detection of aflatoxin M1［J］. Food Control， 2013， 29（1）：208-212.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances on Rapid Detection Methods for Aflatoxin Based on Biological Binders

ZENG Kun DU Dao-lin XUE Yong-lai
（1. College of Environmental and Safety Engineering，Institute of Environment and Ecology，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

Aflatoxins are secondary metabolites secreted by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus，easily pollute the grains and their processed products，and mainly exist in moldy grain，legumes，nuts and associated food products. Aflatoxins are extremely toxic and carcinogenic，especially aflatoxin B1 that has been found to be the strongest natural carcinogen and severely threat to human health. Current detection methods of aflatoxins in the grains are mainly instrumental analysis by combining the high performance liquid chromatography and liquid mass spectrometry，however，instrumental analysis presents the shortcomings such as instruments cost is very high，analysis process is very complex and needs long-time-trained professionals. In recent years，integrating the rapid identification of aflatoxin based on biological binders（antibody，recombinant antibody，and aptamer）and different signal reporters，a series of analysis methods for aflatoxin were established，and they are fast，flexible，and easy to operate，therefore widely applied in food safety. Here we review the rapid detection methods mainly from 2 aspects of specific biological binders for aflatoxins and signal reporters，compare and evaluate them，also prospect the development trend of rapid methods for aflatoxin.

aflatoxin；antibody；aptamer；rapid detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.009

2015-11-18

國家自然科學(xué)基金項目（31502118，31170386，31570414），江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20130507，BK2012274），中國博士后基金項目（2013M541606），江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［CX（13）3093］，江蘇大學(xué)高級人才啟動金（13JDG016），鎮(zhèn)江市科技支撐計劃項目（NY2013006），鎮(zhèn)江市國際科技合作項目（GJ2014008）

曾昆，女，博士，研究方向：污染物快速分析；E-mail：kjj80116@163.com

杜道林，男，博士，研究方向：環(huán)境污染物生態(tài)效應(yīng)；E-mail：daolindu@163.com