安娜 吳友根 陳萍

（海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，?？?570228）

基因分離及克隆技術(shù)在熱帶果樹(shù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

安娜 吳友根 陳萍

（海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海口 570228）

以常見(jiàn)的幾種熱帶水果（香蕉、番木瓜、芒果、菠蘿和荔枝等）為例，總結(jié)了近年來(lái)利用常見(jiàn)的技術(shù)手段如cDNA末端快速克隆技術(shù)（repid-amplification of cDNA ends，RACE）和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）等方式進(jìn)行基因分離，并將成功克隆出的目的基因或片段進(jìn)行基因分析與表達(dá)研究，最后闡述了基因分離與克隆技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與缺陷，對(duì)基因分離及克隆技術(shù)提出了展望，旨為今后科研人員進(jìn)行進(jìn)一步的基因分子生物學(xué)水平上的熱帶果樹(shù)研究與熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

熱帶果樹(shù)；基因；分離；克隆

南回歸線(xiàn)與北回歸線(xiàn)之間的地區(qū)為熱帶地區(qū)，適應(yīng)這種熱帶地區(qū)氣候并能夠在該地區(qū)生長(zhǎng)的果樹(shù)通常被人們稱(chēng)之為熱帶果樹(shù)，海南及云南南部熱帶、亞熱帶水果種類(lèi)非常豐富，有些為海南所特有的熱帶水果品種。近年來(lái)，基因分離技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域，也逐漸被更多地應(yīng)用到熱帶果樹(shù)的研究上，基因克隆技術(shù)成熟大約是在20世紀(jì)70年代初期，通?；蚩寺〖夹g(shù)是將來(lái)自不同生物的基因與能夠進(jìn)行自我復(fù)制的載體DNA在體外進(jìn)行人工拼接，構(gòu)建成新的cDNA文庫(kù)，常見(jiàn)的基因分離方法有基因文庫(kù)、基因芯片、功能蛋白組分離目的基因、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、mRNA差別顯示、插入突變分離克隆目的基因、圖位克隆目的基因、酵母雙雜交系統(tǒng)分離克隆基因、生物信息學(xué)技術(shù)以及諸如基因表達(dá)系列分析（SAGE）、抑制性差減雜交（SSH）等的克隆基因新技術(shù)［1］。如今科研人員最常用的幾種主要方法為功能克隆法、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、序列克隆法、圖位克隆法、mRNA差別顯示PCR法、差別篩選法和差減雜交等。這些分子生物學(xué)方法，并不是只能單獨(dú)使用，也能夠?qū)煞N或多種方法結(jié)合使用以提高目的基因分離的精度與純度。下面根據(jù)主要的熱帶果樹(shù)品種來(lái)闡述近年來(lái)基因分離與克隆技術(shù)成功應(yīng)用的實(shí)例與總結(jié)。

1 熱帶果樹(shù)基因分離技術(shù)應(yīng)用與總結(jié)

1.1 香蕉基因分離的研究

香蕉（Musa nana Lour.）是一種大眾普遍喜愛(ài)的熱帶水果，近年來(lái)，基因分離技術(shù)在香蕉選種育種中發(fā)揮了重要的作用，目前香蕉的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，2012年，由法國(guó)研究人員領(lǐng)導(dǎo)的國(guó)際小組采用Roche454、Sanger和Illumina的測(cè)序方法成功繪制出了523 Mb的香蕉雙單倍體小果野蕉的基因組圖譜。張俊芳［2］在2013年通過(guò)SSH技術(shù)克隆出了香蕉乙烯應(yīng)答因子結(jié)合蛋白（ethylene responsive factor binding protein，ERF）基因并命名為MaERF和決定表皮毛發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MYB基因并命名為MaMYB基因，這些基因都與香蕉的果皮帶毛基因有關(guān)；趙巧陽(yáng)［3］在其實(shí)驗(yàn)中克隆了1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因，ACS是乙烯合成中的限速酶，對(duì)今后香蕉品種的改良研究具有十分重要的價(jià)值。但是香蕉枯萎病讓大量的香蕉絕產(chǎn)，基因分離技術(shù)在香蕉病害的研究也日漸成熟，陳雅平等［4］通過(guò)運(yùn)用抗病基因同源克隆技術(shù)（RGAs）發(fā)現(xiàn)，WNB1和WST1的表達(dá)量增加，表明這兩個(gè)同源抗病基因可能和香蕉枯萎病的抗性有一定關(guān)系；孫嘉曼［5］在其文章中提到運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行更加深入的研究。還有一些研究著重于香蕉自然抗性上，劉德兵［6］在實(shí)驗(yàn)中用ADGE法分離了與冷誘導(dǎo)相關(guān)的基因；匡云波［7］在其實(shí)驗(yàn)中克隆了大量的與香蕉葉片糖代謝有關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因（AMY、BMY、SPS、SSIII、SuSy、Inv和GBSSI），并研究了其在低溫脅迫下的表達(dá)；Wang等［8］克隆了8個(gè)鈣依賴(lài)性蛋白激酶（CDPK）基因，該基因在香蕉苗的生長(zhǎng)與脅迫應(yīng)答中扮演重要角色，Wang等［9］從香蕉中克隆了MaARF基因，并分析了其在香蕉成熟過(guò)程中的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)證明該基因在香蕉采后成熟過(guò)程中有誘導(dǎo)乙烯的合成的作用。

1.2 番木瓜基因分離的研究

番木瓜（Carica papaya L.）是一種常見(jiàn)的并且含有豐富營(yíng)養(yǎng)成分的大眾非常喜愛(ài)的熱帶水果。2008年，首個(gè)番木瓜基因草圖被成功繪制出來(lái)，這張草圖是由南開(kāi)大學(xué)和美國(guó)的研究機(jī)構(gòu)一起進(jìn)行的聯(lián)合研究。該草圖成功繪制出了90%的番木瓜基因編碼序列，番木瓜是到目前為止有詳細(xì)基因組信息的第5個(gè)被子植物。其它的幾種植物分別為擬南芥、水稻、白楊和葡萄。番木瓜屬于呼吸躍變型水果，Mason等［10］從番木瓜中分離了兩個(gè)ACC合成酶基因的cDNA全長(zhǎng)，Lin等［11］、Hidalgo等［12］也都克隆了ACS基因，申艷紅［13］克隆了內(nèi)參基因CpActin全長(zhǎng)cDNA序列，番木瓜果實(shí)半定量RT-PCR分析技術(shù)體系也成功建立了；李澤友［14］克隆了與番木瓜芐基硫苷類(lèi)物質(zhì)（benzyl glucosinolate，BG）生物合成相關(guān)的基因它們分別是（CP-CYP79A2.1、CPCYP79A2.2、CP-CYP83B、CP-C-S、CP-UDP-T及CPST5a），這些相關(guān)基因可編碼產(chǎn)生有防癌抗癌功能的異硫氰酸酯類(lèi)物質(zhì)；言普等［15］克隆了番木瓜的IF（iso）4E基因；林瑩［16］在實(shí)驗(yàn)中克隆出了具有抗軟化功能的果膠裂解酶基因（pectinlyase，PL），為耐貯藏番木瓜的育種工作打下了基礎(chǔ)；申艷紅利用cDNA-AFLP技術(shù)克隆出了番木瓜半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CP）的CpCP基因，該基因?qū)儆贑1肽酶家族中的C1A亞家族，與番木瓜果實(shí)成熟衰老進(jìn)程有關(guān)［17］；趙新偉［18］利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆了類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑相關(guān)的PDS、ZDS和LCY-B的cDNA 序列，為番木瓜果肉顏色形成機(jī)理研究奠定了分子基礎(chǔ)；Vallejo-Reyna 等［19］克隆了乙烯影響因子ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，并分析了其在不同組織中的表達(dá)差異；番木瓜環(huán)斑花葉病是一種流傳于番木瓜間的病毒性病害，杜中軍等［20］根據(jù)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類(lèi)（serine/threonine protein kinase，STK）抗病基因產(chǎn)物催化結(jié)構(gòu)域I和IX的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，克隆了gPK1-gPK5和cPK1-cPK4基因；與抗病有關(guān)的同源基因（Resistance Gene，R）也從番木瓜中被成功克隆；徐兵強(qiáng)［21］運(yùn)用了根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物尋找R基因同源序列（resistance gene analogs，RGA）的方法從番木瓜中成功克隆出了2條NBS-LRR類(lèi)（Nucleotide bindingsite-leucine-rich repeats）RGAs序列和5條STK類(lèi)RGAs序列。

1.3 芒果基因分離的研究

芒果（Mangifera indica L.）是一種熱帶漆樹(shù)科常綠大喬木果樹(shù)，在中國(guó)的南方的邊疆六省（海南、廣東、廣西、云南、福建和臺(tái)灣）都有種植，原產(chǎn)自印度，孟加拉、中南半島和馬來(lái)西亞也有種植，世界各地廣為流傳，中國(guó)栽培已達(dá)40余個(gè)品種，對(duì)于芒果的研究一般集中在芒果成熟及其抗性相關(guān)基因上。李運(yùn)合等［22］采用RT-PCR結(jié)合RACE方法從芒果品種紫花芒中分離了乙烯受體基因MiETR1b，并對(duì)此基因進(jìn)行分析，得出MiETR1b為ETR1家族同源基因，參與調(diào)控不定根的形成；肖潔凝等［23］采用SSH方法分離了芒果中與子葉切段不定根形成相關(guān)的基因，這些基因與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及酶基因的DNA序列同源；趙常志［24］采用RTPCR和RACE方法從芒果果實(shí)中克隆得到了查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）的全長(zhǎng)cDNA序列，該酶是類(lèi)黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶；趙常志用3' RACE和5' RACE法分離得到了芒果果實(shí)PAL的基因序列，PAL是酚類(lèi)物質(zhì)合成的第一個(gè)酶，對(duì)不同芒果品種的PAL基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，紅色貴妃品種該基因的表達(dá)量高，而綠色桂七品種中該基因的表達(dá)量低［25］；魏軍亞［26］利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1，SOC1）基因，該基因有調(diào)控植物開(kāi)花的作用，命名為MSOC1；劉洋等［27］從金煌芒基因組DNA中分離得到了10條具有潛在功能的抗病基因片段；張波等［28］運(yùn)用同源克隆的方法克隆了與調(diào)控花色苷合成有關(guān)的DRF基因，并分析了不同芒果品種中該基因的表達(dá)差異；董龍等［29］對(duì)四季芒不同逆境脅迫處理樣品做基因差異顯示研究，設(shè)計(jì)引物，從中克隆了類(lèi)黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid sulfotransferase）基因（MiST），類(lèi)黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶這一基因可能與芒果中的黃酮生物合成有關(guān)。余海霞等［30］根據(jù)芒果cDNA-SCoT差異顯示中發(fā)現(xiàn)的cDNA片段設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)運(yùn)用RACE技術(shù)獲得了芒果MiNAC基因的全長(zhǎng)cDNA序列，該基因參與芒果逆境脅迫的分子調(diào)控；張宇等［31］采用RTPCR和RACE技術(shù)順利從芒果的枝梢中分離出了芒果的肉桂酰輔酶-A還原酶基因（CCR），該基因參與木質(zhì)素生物合成，后又對(duì)此基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；Nakagawa等［32］從芒果中分離了與成花有關(guān)的基因FT-like和GA代謝相關(guān)的基因GA3-ox，MiFT被認(rèn)為是芒果開(kāi)花的關(guān)鍵基因，該基因的表達(dá)調(diào)控經(jīng)由GA代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)；Ish-Shalom等［33］分離了乙烯受體基因ERS1，并命名為MiERS1，并指出MiERS1具有的特殊功能，調(diào)控小果的脫落。

1.4 菠蘿基因分離的研究

菠蘿（Ananas comosus Linn. Merr.）是鳳梨屬鳳梨科植物，多年生常綠草本，適應(yīng)熱帶和亞熱帶氣候，明末清初傳入中國(guó)南方等地［34］。DNA克隆技術(shù)在菠蘿中的應(yīng)用很廣泛，如菠蘿花發(fā)育相關(guān)基因的克隆、菠蘿果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因的克隆、菠蘿抗逆相關(guān)基因的克隆等。馬均等［35，36］克隆并分析了菠蘿的體細(xì)胞胚發(fā)生類(lèi)受體蛋白激酶（SERK）基因，該基因與早期的體胚誘導(dǎo)與形成有關(guān)，并將AcSERK2與AcSERK1進(jìn)行了比較；王尉等［37］利用生物信息學(xué)分析已構(gòu)建的菠蘿果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的cDNA文庫(kù)，對(duì)未知基因序列重復(fù)同源性檢索、拼裝，用RT-PCR驗(yàn)證目的基因的正確性，克隆了與菠蘿果實(shí)發(fā)育相關(guān)的RFD1基因；蔡元保等［38］利用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)，從菠蘿花中分離出了一個(gè)新的與菠蘿花器官發(fā)育和開(kāi)花誘導(dǎo)過(guò)程中起重要作用的MADS-box基因，并分析了此基因在菠蘿果肉以及花器官的雌蕊、花瓣和萼片中的表達(dá)量；楊祥燕等［39］通過(guò)RT-PCR結(jié)合RACE方法從菠蘿幼苗中克隆獲得了一個(gè)新的菠蘿鋅指蛋白基因的cDNA全長(zhǎng)，并命名為AcRCHY1；Lv等［40］分離了FT基因的全長(zhǎng)，命名為AcFT基因，并分析了其表達(dá)差異；Raimbault等［41］從菠蘿的果肉中分離了天冬氨酸蛋白酶基因AcAP1，該基因與菠蘿的低溫脅迫有關(guān)。

1.5 荔枝基因分離的研究

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原產(chǎn)于中國(guó)南部，是亞熱帶果樹(shù)，不耐儲(chǔ)藏，坐果期易落果，與香蕉、菠蘿、龍眼并稱(chēng)“南國(guó)四大果品”。吳建陽(yáng)等［42］用RT-PCR和RACE擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了ACO基因，首次從荔枝中分離得到的ACO基因命名為L(zhǎng)c-ACO1，該基因可能與荔枝幼果的脫落密切相關(guān)；丁峰等［43，44］用RT-PCR方法首次克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全長(zhǎng)，第二次得到兩個(gè)荔枝FT同源基因cDNA全長(zhǎng)，分別命名為L(zhǎng)cFT1和LcFT2，LcAP1基因可能參與荔枝營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，花發(fā)育過(guò)程及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)調(diào)控過(guò)程，F(xiàn)T基因是長(zhǎng)日照途徑中決定植物開(kāi)花時(shí)間的關(guān)鍵基因，是一個(gè)重要的光周期途徑和春花途徑的整合因子；張靜等［45］從荔枝中分離出了一個(gè)與成熟衰老有關(guān)的誘導(dǎo)基因，命名為L(zhǎng)cAsr，該基因作為缺水的保護(hù)性分子發(fā)揮著重要作用，有利于今后輔助研究采后荔枝果實(shí)失水的分子機(jī)理；王凌云等［46］利用RTPCR從荔枝組織中克隆了9個(gè)質(zhì)膜水孔蛋白基因（LcPIP）的cDNA全長(zhǎng)序列，并研究了其組織特異性表達(dá)。

1.6 龍眼基因分離的研究

龍眼（Dimocarpus longan L.）屬于無(wú)患子科龍眼屬多年生木本植物，果實(shí)肉質(zhì)柔滑，沁口味甜，是我國(guó)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值與藥用價(jià)值的名特優(yōu)果樹(shù)。龍眼果實(shí)集中在八月到九月期間上市，由于其上市時(shí)間的過(guò)于集中，因此龍眼的生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)基因的研究也便具有了重要意義。李慧華等［47，48］克隆了胚性愈傷組織ACO氧化酶基因，還克隆了龍眼的胚性愈傷組織生長(zhǎng)素受體基因TIR1和生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白基因ABP1；孟珊等［49］從四季蜜龍眼中分離了LFY基因的啟動(dòng)子，LFY基因與四季蜜的成花特性有關(guān)；陳虎等［50］克隆了龍眼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶DLCCoAOMT基因，該基因可能參與低溫脅迫后植物的生理變化調(diào)控；Winterhagen等［51］從龍眼中分離了兩個(gè)和成花有關(guān)的DlFT1和DlFT2基因，并且還分離了DlAP1-1 和DlAP1-2基因，并做了進(jìn)一步的分析。

1.7 椰子基因分離的研究

椰子（Cocos nucifera L.）棕櫚科椰子屬植物，原產(chǎn)于亞洲東南部、印度尼西亞至太平洋群島，是熱帶木本油料作物之一。具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，全株各個(gè)部分都有重要用途。韓闖等［52］根據(jù)SOD基因保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離出了Cu·Zn-SOD基因片段，超氧化物歧化酶（SOD）催化超氧陰離子（O2-）發(fā)生歧化反應(yīng)，該過(guò)程能夠?qū)Ｒ磺宄矬w內(nèi)的超氧陰離子；肖勇等［53］克隆了椰子的硫脂酶相關(guān)基因（Acyl-ACP）；張琳［54］克隆了椰子胚乳中WRI1-like類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子CoWRI1基因；Gao等［55］從椰子胚乳中分離出了CocoFAD基因，該基因與十六碳烯酸和十八碳烯酸的生物合成有關(guān)；Yuan等［56］從椰子的胚乳中分離出來(lái)了植物溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶LPAAT基因，并命名為CnLPAAT，CnLPAAT基因在Kennedy途徑中的第二步有著重要的催化作用，使酰基鏈從酯酰-CoA轉(zhuǎn)移到溶血磷脂酸（LPA）的sn-2位，后產(chǎn)生的磷脂酸可以進(jìn)行脫磷反應(yīng)合成三酰甘油（TAG）和進(jìn)入磷脂合成途徑參與形成生物膜結(jié)構(gòu)［57］。

1.8 優(yōu)稀果樹(shù)基因分離的研究

優(yōu)稀果樹(shù)的栽培面積小，對(duì)優(yōu)稀果樹(shù)在基因分離方面的相關(guān)研究少，因此下面只做部分介紹。

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），桑科、菠蘿蜜屬常綠喬木，是熱帶果樹(shù)，也是世界上單果重量最重的水果。汪永保等［58］利用RACE技術(shù)從菠蘿蜜中分離出了β-半乳糖苷酶基因（β-GAL），并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。近些年發(fā)現(xiàn)，該基因是與果實(shí)成熟與軟化有密切關(guān)系的糖苷酶類(lèi)物質(zhì)。

番荔枝（Annona squamosa L.），是熱帶、亞熱帶水果，可鮮食，其根部可藥用，治療赤痢等病，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值頗高。番荔枝的花器官發(fā)育過(guò)程中牽涉到大量基因的表達(dá)和調(diào)控，其中AGAMOUS（AG）是C類(lèi)MADS-box家族的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)控雌蕊與雄蕊發(fā)育的功能，是控制花器官形成的一個(gè)重要的基因，劉鍇東等［59，60］通過(guò)試劑盒提取RNA運(yùn)用RACE方法從番荔枝花器官中克隆出了AGAMOUS基因的全長(zhǎng)序列，克隆了與花器官發(fā)育初期發(fā)揮重要作用的LEAFY基因。

蓮霧（Syzygium samarangense）是熱帶常綠果樹(shù)，果實(shí)成熟期從11月到翌年4月，是一種優(yōu)質(zhì)特色水果，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高。韓繼成等［61］從蓮霧的基因組DNA中分離出了乙烯受體基因（osers）的保守片段，對(duì)蓮霧的保鮮貯藏有重要作用，可以用于今后進(jìn)行蓮霧果實(shí)發(fā)育及采后保鮮儲(chǔ)藏等方面的研究。

枇杷（Eriobotrya japonica Thunb. Lindl）原產(chǎn)中國(guó)東南部，果肉香甜，且具有藥用價(jià)值。楊岑等［62］從枇杷中克隆和鑒定了8個(gè)新S-RNase基因，并根據(jù)分離的這8個(gè)基因進(jìn)行了同源性的推導(dǎo)。

2 展望

隨著分子生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們對(duì)基因的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻，高通量測(cè)序技術(shù)的不斷改進(jìn)與完善，擴(kuò)大了熱帶果樹(shù)目的基因分離的研究范圍。目的基因的分離，有利于直接對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控等一系列問(wèn)題的進(jìn)一步研究?，F(xiàn)今，基因測(cè)序技術(shù)諸如RNA-seq等已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到了熱帶果樹(shù)植物（包括一些木本和草本果樹(shù)植物）特別是非模式生物中，使熱帶果樹(shù)的目的基因分離技術(shù)研究進(jìn)入到了一個(gè)迅速發(fā)展的時(shí)期。高通量生物技術(shù)的快速發(fā)展及與多學(xué)科的融合，已經(jīng)可以運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)來(lái)揭示和闡明植物部分生理生化反應(yīng)或代謝機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等方面研究，有望能夠更全面系統(tǒng)地揭示植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)分子機(jī)理，但這些系統(tǒng)研究還需進(jìn)一步深化。技術(shù)的不斷普及與推廣，使分離完整目的基因序列的精度不斷提高，但仍存在著3個(gè)重要的問(wèn)題：一是熱帶果樹(shù)目的基因的分離與克隆只能借鑒模式植物和大田作物，目前已經(jīng)成功克隆和分離的目的基因或片段絕大多數(shù)與果實(shí)的發(fā)育、成熟衰老過(guò)程有關(guān)；二是熱帶果樹(shù)目的基因的分離與克隆方法，與大田作物和模式植物對(duì)比分析不難看出，兩者存在著很大的差異性，因此會(huì)產(chǎn)生一些特殊情況，除少數(shù)草本水果外，大多數(shù)熱帶果樹(shù)為木本植物，受遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)的限制，使其在轉(zhuǎn)基因方面的研究相當(dāng)困難，因此，應(yīng)積極尋找適合熱帶木本果樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)的方法，使其逐漸形成一條有計(jì)劃的科學(xué)的系統(tǒng)研究體系；三是基因分離技術(shù)及方法各自有其優(yōu)點(diǎn)，但也存在著不可避免的缺陷，農(nóng)業(yè)科研人員應(yīng)該根據(jù)自身的需要進(jìn)行選擇，還可根據(jù)實(shí)際要求將多種技術(shù)進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，如將SSH與cDNA芯片聯(lián)合使用等，是今后基因分離與克隆技術(shù)研究發(fā)展的方向所在。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Gene Isolation and Clone Technology of Tropical Fruit Tree

AN Na WU You-gen CHEN Ping
（Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），Ministry of Education，College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University，Haikou 570228）

Firstly, we summarized the isolations of the genes from several common tropical fruits’ genes（banana, papaya, mango, pineapple, litchi, etc.）by frequently used technologies of rapid-amplification of cDNA ends（RACE）and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）, also the analyses and expressions of cloned target genes and fragments. Finally, we discussed the advantages and disadvantages of gene isolating and cloning technologies, and prospected the new gene isolating and cloning technologies, aiming at laying the foundation for studying tropical fruit tree and agriculture at biological level of genetic molecule.

tropical fruit tree；gene；isolation；clone

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.009

2016-06-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560544），海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20153061），海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（HNJG2014-05）

安娜，女，碩士研究生，研究方向：熱帶果樹(shù)與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；E-mail：960089206@qq.com

陳萍，女，博士，副教授，研究方向：熱帶果樹(shù)與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；E-mail：chenping199607@163.com