王玲，趙曉鵬，張文華，常飛，田颯，白瑋，連建華

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，蘭州　730050)

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卵母細(xì)胞成熟與老化的研究進(jìn)展

王玲，趙曉鵬*，張文華，常飛，田颯，白瑋，連建華

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，蘭州730050)

【摘要】哺乳動物卵母細(xì)胞的發(fā)育與成熟是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，是生殖行為的關(guān)鍵，這一過程中的任何差錯都會導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育異常或不孕。研究人類卵母細(xì)胞成熟與老化，對于了解人類胚胎發(fā)育特征以及認(rèn)識反復(fù)流產(chǎn)、胚胎停育、不孕不育等疾病發(fā)病機(jī)制的具有重要意義。本文綜述了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停滯與恢復(fù)、卵母細(xì)胞的核成熟、胞質(zhì)成熟以及卵母細(xì)胞老化等方面研究。

【關(guān)鍵詞】成熟與老化；卵母細(xì)胞

(JReprodMed2016，25(3)：289-293)

哺乳動物卵母細(xì)胞的發(fā)育與成熟是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，是生殖行為的關(guān)鍵，這一過程中的任何差錯都會導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育異?；虿辉小Ｒ虼?，研究卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，特別是卵母細(xì)胞的成熟與老化過程就顯得尤為重要。卵泡中的卵母細(xì)胞被長期阻滯在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期，伴隨著卵泡的生長，卵母細(xì)胞開始生長發(fā)育。卵母細(xì)胞經(jīng)過充分生長，在排卵前FSH和LH的協(xié)同作用下，完成核成熟與胞質(zhì)成熟，只有核質(zhì)都充分成熟的卵母細(xì)胞才可順利完成對精子的重編程而成功受精，并具備支持胚胎的能力[1]。成熟后的卵母細(xì)胞停滯于第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ期)，直到受精或給予適當(dāng)刺激時才能解除停滯并恢復(fù)第二次減數(shù)分裂。如果成熟卵母細(xì)胞不能及時受精，卵母細(xì)胞就會隨著時間的延長而發(fā)生老化，并引起卵母細(xì)胞表現(xiàn)出多種形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、功能狀態(tài)受損及發(fā)育能力下降，嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的受精、胚胎發(fā)育以及子代的健康狀態(tài)[2]。因此，研究人類卵母細(xì)胞成熟與老化對于理解人類胚胎發(fā)育特征以及對于反復(fù)流產(chǎn)、胚胎停育、不孕不育等疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識與治療具有重要意義。本文將對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停滯與恢復(fù)、卵母細(xì)胞的核成熟、胞質(zhì)成熟以及卵母細(xì)胞老化等方面進(jìn)行綜述。

一、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停滯與恢復(fù)

大多數(shù)哺乳動物的卵母細(xì)胞在胎兒期已經(jīng)開始進(jìn)行減數(shù)分裂，并在出生前后停滯在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期[3]。在青春期之后的生殖周期中，停滯在雙線期的卵母細(xì)胞被募集，在垂體促性腺激素FSH和LH分泌高峰的協(xié)同作用下逐漸恢復(fù)減數(shù)分裂、發(fā)生生發(fā)泡破裂、排出第一極體，完成細(xì)胞核成熟與胞質(zhì)成熟，形成MⅡ期卵母細(xì)胞[4]。

1. 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停滯：人類原始生殖細(xì)胞(PGCs)產(chǎn)生于胚胎發(fā)育早期，是發(fā)育為成熟生殖細(xì)胞的前體細(xì)胞。PGCs是一種具有多種分化潛能的干細(xì)胞，其形態(tài)、分子標(biāo)記及體內(nèi)分化潛能都類似于胚胎干細(xì)胞[5-6]。原始生殖細(xì)胞在遷移過程中經(jīng)過細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期，到達(dá)雙線期后期時其染色體散開，外包完整的核膜，第一次減數(shù)分裂發(fā)生停滯。雙線期的卵母細(xì)胞有一定的轉(zhuǎn)錄和翻譯能力，它合成了大量的RNA和蛋白質(zhì)，為卵母細(xì)胞的生長發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。此期在人類中持續(xù)時間較長，可達(dá)數(shù)十年之久[7-8]。

在青春期后的每個生殖周期中，伴隨著卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，卵泡腔逐漸形成，顆粒細(xì)胞分化為兩種不同形式，即靠近卵泡壁的壁層顆粒細(xì)胞和圍繞卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。早期研究認(rèn)為卵泡壁層顆粒細(xì)胞會產(chǎn)生一種小分子多肽類物質(zhì)，稱為卵母細(xì)胞成熟抑制因子(OMI)，它有阻滯卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的生理作用，但其對減數(shù)分裂的阻滯沒有種屬特異性，可以被LH解除[5，9]。

2010年，Zhang等[10]研究認(rèn)為，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的抑制狀態(tài)是通過卵泡壁層顆粒細(xì)胞分泌的C-型鈉肽(NPPC)及其受體(NPR2)之間的協(xié)同作用來完成的。環(huán)腺苷酸(cAMP)和環(huán)鳥苷酸(cGMP)的高表達(dá)對維持卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)發(fā)揮著極其重要的作用，而NPPC能增加cGMP和cAMP在卵丘細(xì)胞以及卵母細(xì)胞中的高表達(dá)，從而維持卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂抑制狀態(tài)。但是，OMI是否就等同于NPPC，還有待進(jìn)一步的研究，因?yàn)镹PPC和NPR2主要是維持完全生長卵泡減數(shù)分裂抑制[11]，而可能還有其它因子(比如卵泡液中的次黃嘌呤)維持小卵泡中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。卵泡細(xì)胞中高水平的NPPC和NPR2表達(dá)維持了LH峰到來之前減數(shù)分裂的阻滯，使卵母細(xì)胞得以充分生長和發(fā)育，對其核質(zhì)同步化成熟發(fā)揮著重要的作用[10，12-13]。

2.卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)：減數(shù)分裂的恢復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，卵母細(xì)胞的細(xì)胞核阻滯在第一次減數(shù)分裂前期雙線期的過程中，其細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行充分的發(fā)育，伴隨著卵泡的逐漸生長，處于早期發(fā)育階段的原始卵泡被募集而開始加快生長。排卵前，LH和FSH協(xié)同作用于顆粒細(xì)胞，引起卵母細(xì)胞中cGMP和cAMP水平下調(diào)，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂、完成核成熟與胞質(zhì)成熟并排卵[14]。

FSH的主要作用是促進(jìn)卵泡生長發(fā)育，而LH的主要作用是促進(jìn)排卵前卵母細(xì)胞的成熟和排卵[15]。在卵泡周期中，F(xiàn)SH和LH受體mRNA在卵泡壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞均有表達(dá)，但是LH受體mRNA在早期卵泡中的卵丘細(xì)胞上處于低水平表達(dá)。隨著卵泡的生長，尤其是在排卵前的大卵泡中，由于FSH的刺激使LH受體mRNA在卵丘細(xì)胞上的表達(dá)升高[4，11-12]。

由于FSH和LH受體存在于顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞上，而卵母細(xì)胞上無表達(dá)，表明促性腺激素是通過顆粒細(xì)胞的介導(dǎo)來完成對卵母細(xì)胞的刺激作用[4]。研究認(rèn)為促性腺激素可誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張，中斷了其與卵母細(xì)胞之間的縫隙連接，使減數(shù)分裂抑制物不能輸入卵母細(xì)胞，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。另一方面，促性腺激素可誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞產(chǎn)生一些促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的物質(zhì)，從而加速卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)[13，16]。

此外，其他機(jī)制，比如cGMP非依賴性的PDE3A活化以及其他的LH和FSH通路，可能也一起參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)調(diào)控，共同促進(jìn)抑制在GV期的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂成熟[11]。

二、卵母細(xì)胞的成熟

在人青春期(動物為初情期)后的每個生殖周期中，部分卵泡啟動發(fā)育，卵母細(xì)胞進(jìn)入迅速生長階段，此時卵母細(xì)胞的核增大，核仁空泡化程度增加，原始卵泡在生長過程中經(jīng)腔前卵泡變?yōu)橛星宦雅?。在早期有腔卵泡階段，卵母細(xì)胞核停止轉(zhuǎn)錄活動，發(fā)生核仁的致密化，卵母細(xì)胞在該期的代謝活動主要以細(xì)胞質(zhì)為主，整個細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成了大量的蛋白質(zhì)和脂滴等營養(yǎng)物質(zhì)，這為卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的恢復(fù)、成熟、受精以及早期胚胎的發(fā)育等奠定了基礎(chǔ)。排卵前夕，由于促性腺激素的刺激，卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，發(fā)生生發(fā)泡破裂后，很快排出第一極體，并停滯在MⅡ期，等待受精[12]。這種始于GVBD，完成于第二次減數(shù)分裂中期，最終形成具有受精能力卵母細(xì)胞的過程就叫卵母細(xì)胞成熟。卵母細(xì)胞成熟的進(jìn)程是涉及核成熟與胞質(zhì)成熟的復(fù)雜生物學(xué)過程[17]，只有核成熟與胞質(zhì)成熟都完成的卵母細(xì)胞才具備成功受精和支持胚胎發(fā)育的能力。

1. 核成熟：伴隨著卵泡的生長發(fā)育，卵母細(xì)胞的核功能逐漸被激活。從原始卵泡中的卵母細(xì)胞到早期有腔卵泡階段的卵母細(xì)胞，染色質(zhì)解聚，呈高度疏松狀，有明顯的核膜和核仁，核仁是由纖維中心、致密纖維組分和顆粒組分構(gòu)成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，空泡核仁發(fā)生致密化，rRNA在核仁中合成并進(jìn)行儲存[8]。核仁逐漸致密化，只有核仁完全致密化，核仁周圍有染色質(zhì)相伴分布時，卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂才能恢復(fù)[18]。隨著卵母細(xì)胞的逐漸發(fā)育，核孔復(fù)合體消失，染色體擴(kuò)散并凝集在核膜內(nèi)緣；然后發(fā)生核膜破裂，核內(nèi)物質(zhì)與核質(zhì)混合，此過程被稱為生發(fā)泡破裂[12，19]。卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂后，很快便完成第一次減數(shù)分裂，并排出第一極體，形成MⅡ期卵母細(xì)胞。至此，卵母細(xì)胞完成核成熟。

2. 胞質(zhì)成熟：在卵母細(xì)胞完成核成熟的過程中，其胞質(zhì)也會發(fā)生許多與成熟有關(guān)的變化。胞質(zhì)成熟比核成熟要復(fù)雜得多且不易觀察，主要包括胞質(zhì)內(nèi)各細(xì)胞器形態(tài)改變和功能建立、mRNA與蛋白質(zhì)的積累以及細(xì)胞代謝方面的變化等[20-21]。

通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞成熟的過程中皮質(zhì)顆粒(CGs)的分布會發(fā)生規(guī)律性變化，在未成熟卵母細(xì)胞中胞質(zhì)內(nèi)的CGs主要分布在皮質(zhì)區(qū)，而成熟卵母細(xì)胞中CGs在質(zhì)膜下呈單層排列，并將此作為卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的重要指標(biāo)[21-22]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi)CGs分布存在明顯的極性，CGs在成熟卵母細(xì)胞內(nèi)的大部分區(qū)域都呈單層排列，但是在第二次減數(shù)分裂紡錘體所在的區(qū)域，其質(zhì)膜下不存在CGs，這個區(qū)域稱為無CGs區(qū)(CGFD)。有研究認(rèn)為這個CGFD是由于CGs的過早外排造成，并將此作為卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的另一個重要指標(biāo)[12，23]。

卵母細(xì)胞在體外成熟的過程中，隨著減數(shù)分裂的完成，卵母細(xì)胞的形態(tài)及胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器的形態(tài)和分布也會發(fā)生與核成熟同步的變化[24]。在未成熟的卵母細(xì)胞中，卵周隙尚未形成，在卵膜表面有大量長形的微絨毛分布，并且垂直插入透明帶內(nèi)。線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、皮質(zhì)顆粒等細(xì)胞器不斷豐富和增多，并逐漸向皮質(zhì)區(qū)遷移，聚集成一個“細(xì)胞器帶”。此時的線粒體主要以長條狀和圓形為主，呈簇狀分布在皮質(zhì)區(qū)，小泡和脂滴分布在線粒體的周圍，CGs均勻分布在整個胞質(zhì)中[12，20，25]。

在成熟卵母細(xì)胞中，除CGs向質(zhì)膜下遷移形成單層之外，卵母細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)胞器均遷移至中央?yún)^(qū)，這種排列狀態(tài)使得皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)一個“細(xì)胞器空虛帶”[26]。線粒體從長條狀和圓形變?yōu)槊睜罱Y(jié)構(gòu)，小泡和脂滴的體積增大，與線粒體相伴而行。卵膜和透明帶之間出現(xiàn)卵周隙，微絨毛數(shù)量減少并從透明帶中撤出，全部倒伏在卵膜表面。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加，囊池膨大，形態(tài)不規(guī)則[20，25]。

3.核質(zhì)同步成熟：在卵母細(xì)胞成熟過程中，核成熟與胞質(zhì)成熟都是至關(guān)重要的，核成熟是精子獲能、穿越透明帶、進(jìn)入卵母細(xì)胞的前提，而胞質(zhì)成熟是卵母細(xì)胞受精和胚胎發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)[23，24]。卵母細(xì)胞的核成熟與胞質(zhì)成熟并非同步，并且核成熟不完全依賴于胞質(zhì)成熟，即核成熟的完成并不能保證細(xì)胞質(zhì)的完全成熟。但是，核成熟與胞質(zhì)成熟是互相獨(dú)立又互相依賴和促進(jìn)的一個整體，核成熟影響著胞質(zhì)成熟，而胞質(zhì)成熟對核成熟又具有促進(jìn)作用。細(xì)胞核的成熟依賴于細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，細(xì)胞質(zhì)的成熟又需要細(xì)胞核的完全成熟[12]。只有達(dá)到充分核成熟和胞質(zhì)成熟的卵母細(xì)胞才可順利完成對精子的重編程而成功受精，并獲得后期的發(fā)育能力[27]。

三、卵母細(xì)胞老化

雖然哺乳動物卵母細(xì)胞完成生長和成熟需要數(shù)月甚至數(shù)年時間，但是其最佳受精時間卻不超過10 h，相當(dāng)短暫[28]。若核質(zhì)成熟都完成的卵母細(xì)胞在輸卵管(體內(nèi))或培養(yǎng)液(體外)中停留時間過長而不能及時受精或激活，卵母細(xì)胞將經(jīng)歷時間依賴性的老化過程[2]。卵母細(xì)胞老化是一個復(fù)雜的、不可逆的生物學(xué)過程，主要表現(xiàn)為孤雌激活和細(xì)胞凋亡。老化會引起包括人在內(nèi)的哺乳動物卵母細(xì)胞的多種形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和機(jī)能狀態(tài)下降，包括DNA受損斷裂、對刺激的敏感性增加、受精率下降、多精受精、孤雌激活、線粒體結(jié)構(gòu)異常、部分皮質(zhì)顆粒外排、細(xì)胞膜完整性受損和通透性下降、透明帶硬化、胚胎發(fā)育遲緩等[29-30]。有研究已經(jīng)證明，老化卵母細(xì)胞受精后出生的子代小鼠會出現(xiàn)神經(jīng)敏感、精神異常、生育能力下降和壽命縮短等現(xiàn)象[31]。目前，隨著體外受精、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)等輔助生殖技術(shù)的廣泛應(yīng)用，卵母細(xì)胞老化已經(jīng)成為顯著制約這些技術(shù)發(fā)展的一個重要因素。

絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)與成熟促進(jìn)因子(MPF)在哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮著重要作用，兩者的激活和/或失活導(dǎo)致了減數(shù)分裂的啟動、阻滯和完成。Qiao等[32]通過免疫蛋白印跡技術(shù)證明，排卵后老化的小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞MPF活性會隨著老化程度的加劇而顯著降低。Keefe等[33]對體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK和MPF活性會隨著培養(yǎng)時間的延長而也逐漸降低?，F(xiàn)認(rèn)為MAPK與MPF失活是克服中期阻滯和受精后原核核膜組裝的重要前提，MPF的活化和失活均早于MAPK[34-35]。

凋亡是老化卵母細(xì)胞的主要表現(xiàn)形式和退化方式[36]，凋亡的一個顯著特點(diǎn)就是卵母細(xì)胞染色體DNA的降解[30]。細(xì)胞凋亡過程中，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，染色體DNA在組蛋白寡聚核小體之間的連接部位被切斷，形成約180～200 bp整倍數(shù)的DNA片段[37]。而趙曉鵬等[30]的研究結(jié)果也表明，卵母細(xì)胞老化程度越嚴(yán)重，其DNA斷裂就會越徹底，從而造成老化卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。

卵母細(xì)胞的老化是在一系列蛋白的協(xié)同調(diào)控下完成的，其中B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bc1-2)家族蛋白是在卵母細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì)。它通過與其它凋亡相關(guān)因子的協(xié)同作用調(diào)控著線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡主開關(guān)的作用[38]。隨著卵母細(xì)胞的逐漸老化，抗凋亡蛋白 Bcl-2的mRNA 和蛋白水平會顯著下降[39]，導(dǎo)致無法阻止卵母細(xì)胞的凋亡，直接或間接地引起MPF和MAPK活性的下降以及紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白(MAD2)表達(dá)的降低[40-41]，從而啟動卵母細(xì)胞的凋亡。凋亡程序啟動后，染色體DNA在核酸內(nèi)切酶的作用下降解[38]。另外，伴隨著Bcl-2表達(dá)水平的下降，促凋亡因子Bax在卵母細(xì)胞中的表達(dá)逐漸上升，從而進(jìn)一步促進(jìn)卵母細(xì)胞凋亡進(jìn)程的加劇[42-43]。

由此可見，卵母細(xì)胞成熟與老化是一個涉及多方面變化的復(fù)雜生物學(xué)過程，只有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都完全成熟的卵母細(xì)胞才具備成功受精并支持后期胚胎發(fā)育的能力。若成熟的卵母細(xì)胞不能及時受精而發(fā)生老化，同樣會嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的受精和胚胎發(fā)育。因此，在實(shí)踐中我們應(yīng)調(diào)控好卵母細(xì)胞的核質(zhì)同步成熟與老化之間的關(guān)系，提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量，以便更好的服務(wù)于我們的生產(chǎn)與生活。

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[編輯：郭永]

Research progress of maturation and aging of oocyte

WANGLing，ZHAOXiao-peng*，ZHANGWen-hua，CHANGFei，TIANSa，BAIWei，LIANJian-hua

CenterofClinicalReproductionMedicine，LanzhouGeneralHospitalofLanzhouMilitaryAreaCommand，PLA，Lanzhou730050

【Abstract】Maturation and development of oocyte is a complex biologic process in mammalian，which is the key event in the reproductive process. Any errors in this process can lead to the oocyte developmental abnormalities or infertility. Research of maturation and aging of oocyte is important for understanding the characteristics of human embryonic development and the pathological mechanism of recurrent miscarriage，embryo development arrest，infertility and other diseases. This paper reviews the research progress of oocyte meiotic arrest and resumption，oocyte nuclear maturation，oocyte cytoplasmic maturation and aging.

【Key words】Maturation and aging；Oocyte

【作者簡介】王玲，女，甘肅天水人，博士，副主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*通訊作者)

【基金項(xiàng)目】蘭州軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目(CLZ14JB08)

【收稿日期】2015-06-14；【修回日期】2015-07-09

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.019