姬洪飛, 王 穎,*

1 西北農(nóng)林科技大學水土保持研究所黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室, 楊凌 712100 2 中國科學院水利部水土保持研究所, 楊凌 712100

分子生物學方法在環(huán)境微生物生態(tài)學中的應用研究進展

姬洪飛1, 2, 王 穎1, 2,*

1 西北農(nóng)林科技大學水土保持研究所黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室, 楊凌 712100 2 中國科學院水利部水土保持研究所, 楊凌 712100

隨著分子生物學方法的不斷發(fā)展和改進,微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的作用被更好的挖掘出來。目前快速發(fā)展的先進的分子生物學技術(shù),已經(jīng)開始應用于分析環(huán)境微生物的多樣性、微生物的生物地理學及微生物對氣候變化的響應等。一般環(huán)境微生物的研究目標主要有3個,即確定微生物的種類和多樣性、微生物的功能或潛在作用及在特定時間點活躍的微生物等。然而,現(xiàn)有微生物的研究方法復雜多樣,容易給研究者在方法的選擇上帶來困惑。將從微生物的多樣性和功能研究兩個方面介紹和分析相應的分子生物學方法,尤其是近年來快速發(fā)展的高通量測序、宏組學和單細胞水平研究方法(如納米二次離子質(zhì)譜與熒光原位雜交相結(jié)合的方法)等新技術(shù)及其應用情況,以期為研究者選擇合適的研究方法進行環(huán)境微生物的研究提供依據(jù)。

微生物多樣性；微生物功能；同位素標記；高通量測序；宏基因組/宏轉(zhuǎn)錄組；單細胞水平研究方法

微生物包括細菌、古菌、真菌等,是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,幾乎存在于所有已知的環(huán)境中,在生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用,如維持生態(tài)系統(tǒng)功能、直接參與碳、氮、硫、磷和一些金屬的生物地球化學循環(huán)[1]、加快污染環(huán)境修復進程等[2]。此外,微生物在生態(tài)系統(tǒng)對氣候變化的響應方面也可能起著重要作用[3]?；谖⑸镌谏鷳B(tài)系統(tǒng)中所發(fā)揮的重要作用,環(huán)境和生態(tài)學研究的學者對理解生態(tài)系統(tǒng)中微生物的動態(tài)變化興趣漸濃。

目前環(huán)境微生物生態(tài)學的研究主要集中在確定所研究的環(huán)境中有哪些微生物存在和分析微生物在所研究的環(huán)境中起什么樣的作用或執(zhí)行哪個生態(tài)功能[4]兩個方面,此外,微生物之間以及微生物與環(huán)境因子之間的相互作用受到越來越多的關注。由于微生物個體小(平均直徑約1 μm),肉眼不可見且未知,微生物的研究方法的發(fā)展加速了研究者對微生物的認知。在過去的十多年中,微生物的研究方法得到了快速發(fā)展,且商業(yè)化迅速,特別是高通量測序、宏組學和單細胞水平研究方法(如納米二次離子質(zhì)譜與熒光原位雜交相結(jié)合的方法)等(圖1)[4]技術(shù)手段使微生物研究的難度和成本都得到了顯著改善。隨著研究方法的發(fā)展,微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的作用可以被更好的挖掘出來。然而,快速發(fā)展的微生物研究方法,以及之前已有的研究方法,給不熟悉這些技術(shù)的研究者在方法的選擇上帶來了困惑。因此,本文將從微生物的多樣性和功能分析兩個方面對相應的研究方法進行闡述,并以1—2篇文獻為例具體介紹相關方法在微生物生態(tài)學研究中的應用,以期為研究者選擇合適的研究方法進行環(huán)境微生物的研究提供參考。

1 環(huán)境微生物的多樣性分析

在很多微生物生態(tài)學的研究中,首先是分析所研究的環(huán)境中有哪些微生物,以及微生物的多樣性和分布情況。微生物研究的傳統(tǒng)方法首先是獲取環(huán)境樣品,然后對其進行分離培養(yǎng)得到微生物的單菌株。然而,很多微生物難以通過現(xiàn)有的培養(yǎng)方法得到[5],使微生物的多樣性分析受到很大限制。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法不同,現(xiàn)代分子生物學技術(shù)直接以從環(huán)境樣品中提取的核酸(DNA和RNA)為分析對象,以特定的核酸片段為生物標志物,理解該環(huán)境中微生物的組成和多樣性,即將所提取的DNA進行目標片段的PCR擴增,得到的PCR產(chǎn)物通過多種技術(shù)來鑒定其組成的多態(tài)性,如群落結(jié)構(gòu)分析的指紋圖譜、微列陣(Microarray)和高通量測序等。微生物多樣性分析的研究中,PCR擴增的目標片段可以選擇微生物的一段相對保守而又足以區(qū)分不同類群的基因區(qū)域,如細菌和古菌常用的16S rRNA[6]、真菌的18S rRNA或ITS區(qū)[7]等；同時,一些微生物的功能基因也可用于分析功能微生物的多樣性,如氨氧化細菌的氨單加氧酶amoA基因(氨單加氧酶,催化硝化作用的第一步)。得到目標基因的PCR產(chǎn)物后,可根據(jù)需求選擇下面的方法進行微生物的多樣性分析(圖1)。

圖1 微生物生態(tài)學研究中分子生物學方法的應用選擇圖[4]Fig.1 Decision diagram for choosing a molecular approach for use in microbiology studies[4]

1.1 變性梯度凝膠電泳和末端限制性片段長度多態(tài)性

變性梯度凝膠電泳(DGGE)和末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)均是通過電泳對PCR產(chǎn)物進行分型,從而分析微生物的多樣性和相對豐富度,在分析環(huán)境中優(yōu)勢微生物群落(相對豐富度>1%的微生物種群)[8]的變化方面具有較多的應用(表1)。DGGE和T-RFLP是應用于環(huán)境微生物多樣性分析中較早的分子生物學方法,不僅應用方便,分辨率高,且價格低廉。DGGE主要用于分析低于500 bp的片段；T-RFLP對低于500 bp的酶切片段分型精度較高,而高于500 bp的酶切片段分型精度則不足。DGGE條帶可通過切膠回收、構(gòu)建克隆文庫和測序來了解感興趣的條帶的系統(tǒng)發(fā)育信息或物種信息,而對于復雜的微生物群落組成(如土壤細菌的群落組成)的分析,T-RFLP的分辨率高于DGGE。

1.2 微列陣(Microarray)

基因微列陣用來分析樣品中微生物的組成和多樣性,已經(jīng)用了將近20年,經(jīng)歷了數(shù)代的改進,常用的微列陣有系統(tǒng)發(fā)育芯片(PhyloChip,用于識別微生物以及微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育聯(lián)系,分析微生物的多樣性)和功能基因芯片(GeoChip,用于研究功能基因的多樣性和功能微生物的活性)。微列陣即為排滿探針(用于和樣品DNA進行雜交的已知短序列)的芯片,通過探針提供生物的系統(tǒng)發(fā)育信息或功能性質(zhì)信息、或者二者均包含。當樣品中的序列(純菌、環(huán)境樣品DNA或RNA的目標片段的熒光標記PCR產(chǎn)物或隨機引物的熒光標記PCR產(chǎn)物)與探針進行雜交后,即可計算與探針匹配序列的相對熒光比例,從而獲得微生物的多樣性和相對豐富度信息。

基因微列陣的方法尤其適合識別不同時間、地點和處理之間的代表微生物或微生物群落的差別,此外,功能基因芯片還可以定量C、N、S和P循環(huán)、有機污染物降解和脅迫響應等相關的功能基因的變化。Aronson等[19]利用3代PhyloChip(16S rRNA基因微列陣,可以提供60000個左右不同OTU的信息),研究不同實驗條件下松林土壤甲烷循環(huán)的相關微生物,分析了土壤中甲烷氧化菌(Methanotrophs)和產(chǎn)甲烷菌(Methanogens)的多樣性及其與土壤中甲烷通量變化之間的聯(lián)系。該方法不僅檢測到了目標群落在不同時間、地點和氮水平處理之間的差異,同時發(fā)現(xiàn)了群落中占少數(shù)的微生物的變化,而在克隆篩選的方法或深度不夠的高通量測序中,這些少數(shù)微生物的差異均可能被忽略。Cong等[20]利用GeoChip 5.0(覆蓋了393個功能基因家族)分析了熱帶雨林土壤微生物的功能基因的組成和多樣性,發(fā)現(xiàn)所檢測到的基因類型與生物地球化學過程有關,如碳、氮和磷循環(huán)相關的功能基因,其中,碳循環(huán)相關基因包括易降解和難降解底物的相關微生物基因,在3個取樣地點之間顯著不同,典范對應分析和多元回歸樹分析均顯示土壤有效氮含量與土壤微生物功能基因的組成和代謝潛力顯著相關。

表1 分子生物學方法在環(huán)境微生物生態(tài)學中的應用情況

1.3 高通量測序

Sanger測序已經(jīng)用了幾十年,測序質(zhì)量高,序列長度達750—1000 bp。該方法無法測混合序列,需首先建立克隆文庫,即將目標序列轉(zhuǎn)移到寄主細胞(一般為Escherichiacoli)中進行培養(yǎng),形成單菌株,然后對單菌株中的目標序列進行測序,在分析微生物多樣性較高的環(huán)境樣品時,費時且費用高。

在過去十年中,測序方法得到了很大改進,在Sanger測序方法的基礎上,用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP,當DNA聚合酶合成互補鏈時,每添加一種dNTP就會釋放出相應的熒光,捕捉到的熒光信號經(jīng)過特定的計算機軟件處理,從而獲得待測DNA的序列信息,即邊合成邊測序,也稱為二代測序。該方法以微生物目標基因的PCR產(chǎn)物為樣本進行測序,一個反應得到幾萬至幾百萬條序列,測序的廣度和深度大大提高。目前用于環(huán)境樣品中微生物多樣性分析的常用方法有2種,即Roche Inc公司的454焦磷酸測序和Illumina Inc公司的MiSeq/HiSeq測序,這兩種高通量測序方法通過在每個樣品的引物上加標簽來識別不同樣品的序列,均可以同時分析多個環(huán)境樣品,并得到大量序列。此外,高通量列陣(The Access Array 48.48, AA48.48, Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA, USA)通過使用陣列芯片,可同時進行2304個PCR的擴增,將樣品定量PCR和序列文庫PCR在一個反應中同時完成,該PCR產(chǎn)物可直接用于二代測序分析,僅需5 h,與二代測序相結(jié)合,可同時得到微生物的群落組成和豐富度信息,簡化二代測序樣本的制備程序[21]。目前,很多研究中應用的測序方法依然是454焦磷酸測序。然而,Roche于2013年10月聲明454焦磷酸測序?qū)⒃?015年底停止運營,但現(xiàn)有的454測序儀還將繼續(xù)運行。與454焦磷酸測序相比,Illumina平臺測序的通量大大提高,序列長度不斷改進,費用也有所降低。因此,Illumina平臺測序以及其他一些測序方法(如Helicons、Pacific Biotechnology和Oxford Nanopore System的單分子測序)在今后的環(huán)境微生物研究中將會有更多的應用。

二代測序的測序廣度和深度較克隆文庫的方法大大提高,尤其是提高了對數(shù)量上占少數(shù)的微生物群落的覆蓋,不僅能從群落水平上揭示微生物群落組成的變化,還能從更細的微生物分類水平上顯示微生物群落的具體變化,在環(huán)境樣品的16S rRNA、18S rRNA、真菌的ITS區(qū)和功能基因的分析中均有應用[6-7,22-23]。寒帶針葉林在全球的占地面積約為11%,占土壤有機碳儲量的16%,一般認為地上部的植物殘體是土壤有機碳累積的主要來源。而Clemmensen等[24]等通過分析北方森林土壤年代序列的有機碳組成發(fā)現(xiàn),50%—70%的土壤有機碳儲量源于根系和根系伴生微生物,且穩(wěn)定同位素標記與真菌ITS區(qū)的454焦磷酸測序相結(jié)合的研究結(jié)果表明,在不同地點之間,有機碳累積差異最大的土壤剖面中,根系伴生真菌均占優(yōu)勢,說明根系伴生真菌在生態(tài)系統(tǒng)的碳動態(tài)中起重要的調(diào)節(jié)作用。Hermann-bank[21]將高通量列陣與二代測序的方法相結(jié)合,分析了腸道微生物的豐富度和組成,結(jié)果表明,不同腸道位置或腹瀉情況下的腸道微生物組成和豐富度不同,腹瀉與鏈球菌屬(Streptococcus)成員的數(shù)量顯著降低相關,尤其是非解乳鏈球菌(S.alactolyticus)。盡管目前高通量列陣與二代測序相結(jié)合的方法的應用較少,該研究依然顯示了高通量列陣在定量不同樣品中微生物的豐富度的同時,通過與二代測序相結(jié)合具有快速得到微生物系統(tǒng)發(fā)育信息的潛力。

2 環(huán)境微生物的功能性質(zhì)和基因表達分析

除了理解微生物的多樣性和群落組成之外,很多時候還需要分析這些微生物成員的功能,如微生物的多樣性與其功能性質(zhì)有什么樣的聯(lián)系,以及微生物與其所在生態(tài)系統(tǒng)中的能量和養(yǎng)分流動是如何相互作用的等。微生物功能分析常用的方法包括穩(wěn)定同位素標記與微生物DNA或RNA分析相結(jié)合的方法、功能基因微列陣(見1.2)、微生物宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組分析及單細胞水平研究方法來識別目標微生物的種類和功能的方法。

2.1 穩(wěn)定同位素標記與DNA或RNA相結(jié)合

將水體、土壤、沉積物以及其他生態(tài)系統(tǒng)中的微生物的種類和功能聯(lián)系起來一直是微生物生態(tài)學研究的主要目標之一。過去二十幾年的研究中,環(huán)境微生物的種類和功能研究已經(jīng)得到了大量結(jié)果,而二者的直接聯(lián)系,仍然是個薄弱環(huán)節(jié)[25]。穩(wěn)定同位素和放射性同位素技術(shù)將不可培養(yǎng)的微生物種類和代謝功能相聯(lián)系起來,是微生物生態(tài)學發(fā)展中的重要進步。穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(Stable isotope probing,SIP))采用穩(wěn)定同位素(如13C,15N和18O等)標記的底物[26-28],使利用這些底物的微生物的標志物(DNA、RNA、蛋白質(zhì)或磷脂脂肪酸(PLFA))被標記(表2),從而從群落水平識別環(huán)境中活躍的微生物以及微生物之間的相互作用。

表2 DNA-SIP、RNA-SIP、PLFA-SIP和 protein-SIP 方法方面的比較[2]

SIP實驗雖然只能應用于富集培養(yǎng)物或環(huán)境群落的密閉培養(yǎng)實驗,但是該方法是目前唯一可以將微生物種類和代謝功能直接聯(lián)系起來的方法,還可用于分析植物和微生物之間的相互作用。其中,DNA-SIP和RNA-SIP均可將微生物的系統(tǒng)發(fā)育信息或功能基因信息與其代謝過程相聯(lián)系起來,操作較容易,且分辨率高,在環(huán)境樣品,尤其是較復雜的環(huán)境樣品的分析中(如土壤)應用廣泛,并常與其他DNA或RNA分析的方法相結(jié)合來分析環(huán)境樣品中活躍代謝標記底物的微生物群落組成,如熒光實時定量PCR、DGGE[22]、T-RFLP[23]、微列陣[29]和高通量測序(目標基因或宏組學)[22-23,30]等(表1)。缺氧的水稻土壤微生物對甲烷排放的貢獻占全球甲烷排放的10%—25%,而甲烷產(chǎn)生的主要碳源是植物殘體和根系分泌物,識別活躍代謝植物殘體和根系分泌物且產(chǎn)生甲烷的微生物種群具有重要的環(huán)境意義。Lu等[31]通過采用13CO2代替空氣中的CO2對水稻進行脈沖標記,分析根際土壤活躍代謝根系分泌物的微生物,發(fā)現(xiàn)根際土壤中古菌Rice Cluster I 顯著同化了13C,說明該類古菌在植物分泌物或殘體分解產(chǎn)生甲烷的過程中起著重要的作用。Kim等[23]采用13C-甲苯標記海洋沉積物中微生物,通過DNA-T-RFLP分析發(fā)現(xiàn),與輕DNA組分(理論上為12C-DNA)相比,重DNA組分(理論上為13C-DNA)中酶切片段為485 bp的峰占優(yōu)勢,系統(tǒng)發(fā)育上屬于硫單胞桿菌屬(Desulfuromonas)；通過宏基因組學的方法,發(fā)現(xiàn)該菌除了具有嚴格厭氧菌的II型苯甲酰輔酶A還原酶之外,還具有兼性厭氧菌的I-型苯甲酰輔酶A還原酶,另外,還識別出了各種厭氧電子受體和編碼末端氧化酶的相關基因,從而推斷出該屬微生物代謝甲苯的潛力。

2.2 宏基因組學和宏轉(zhuǎn)錄組學

微生物基因組和轉(zhuǎn)錄組,即提取一種已知生物的DNA或RNA,不進行目標片段的PCR擴增,隨機打斷成幾百個堿基的片段進行測序,得到全面的遺傳信息,也稱為鳥槍測序法。與基因組學和轉(zhuǎn)錄組學不同的是,宏基因組學和宏轉(zhuǎn)錄組學反映的是多種生物或環(huán)境中整個群落的特征,包含環(huán)境微生物的全部遺傳信息,相比于16S rRNA,除了群落中各種微生物群落的分類信息外,宏組學更包含了所有微生物的基因信息,有助于對微生物群落的潛在功能進行深入分析[32]。宏基因組學的挑戰(zhàn)有2個方面,一是從隨機測序的短序列中識別和定量基因功能,二是將這些功能基因片段與其他可以作為分類信息參考的基因聯(lián)系起來,一般功能基因主要通過將測得的短序列與已經(jīng)發(fā)表的或已注釋的基因組進行比對來識別[4],與已有的參考數(shù)據(jù)庫信息直接相關。宏轉(zhuǎn)錄組學和宏基因組學的區(qū)別在于,宏轉(zhuǎn)錄組學可以實時反映微生物群落的基因表達情況,得到的信息包括樣品中哪些生物在當前是活躍的,以及它們在做什么。微生物細胞和環(huán)境樣品中(如土壤)RNA的滯留時間顯著低于DNA,因此,環(huán)境樣品中提取的RNA理論上是該樣品當前生物基因表達的一個快照。深度宏組學研究常用來理解復雜微生物群落的動態(tài),然而,這類項目(尤其是在土壤中)所需的計算資源依然受到限制,如計算機硬件和數(shù)據(jù)處理方面。目前,雖然計算所需硬件的限制仍然存在,但是數(shù)據(jù)處理方面發(fā)展迅速,如WebCarma[33], MG-RAST[34],Galaxy[35]和GenePattern[36]等工具已經(jīng)得到了廣泛的應用。

宏基因組學和宏轉(zhuǎn)錄組學呈現(xiàn)的是多種生物或環(huán)境中整個群落的特征,包含環(huán)境微生物的全部遺傳信息；與穩(wěn)定同位素標記相結(jié)合,較其他微生物多樣性分析的方法,宏組學

可以更全面的反應代謝特定底物的微生物的信息。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,宏組學的方法在環(huán)境微生物的研究中已有較多的應用,包括土壤、湖泊和海洋等生態(tài)系統(tǒng)[23,30,37]。Xia等[38]采用宏基因組學和宏轉(zhuǎn)錄組學的方法分析了高溫下纖維素厭氧降解產(chǎn)生甲烷的過程的微生物群落,結(jié)果表明,在纖維素高溫降解過程中,熱袍菌(Thermotogales)對β-糖的消耗是纖維素水解過程中的關鍵步驟；盡管纖維素發(fā)酵過程產(chǎn)生大量的乙酸,嗜乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcinales)的豐富度較嗜氫甲烷桿菌(Methanobacteriales)低60%,而關鍵基因的轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果表明,乙酸降解產(chǎn)甲烷途徑的活躍程度顯著高于嗜氫產(chǎn)甲烷途徑,說明嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌在數(shù)量上占少數(shù)并不代表其代謝活性低。

2.3 單細胞水平研究方法識別目標微生物的種類和功能

穩(wěn)定同位素與微生物的DNA或RNA(DNA/RNA-SIP)相結(jié)合,可以從群落水平將微生物的種類、組成與其功能相聯(lián)系起來,但是對微生物單細胞水平的代謝活性以及不同種類微生物細胞的代謝活性的差異等信息依然難以揭示。隨著單細胞成像方法的改進,結(jié)合穩(wěn)定同位素或放射性同位素標記和熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization, FISH),可將微生物的數(shù)量、種類和功能以及一些微生物之間的相互作用從視覺上展現(xiàn)在圖片中。放射性自顯影技術(shù)(Microautoradiography, MAR)是最早的微生物單細胞活性的測定方法之一,靈敏度高,放射性底物的檢測量最低可達10-10—10-15mg[39],然而,該方法的應用受到標記元素的限制,標記元素需要同時具有放射性和合適的半衰期兩個條件。拉曼光譜學顯微技術(shù)(Raman spectroscopy, Raman)和納米二次離子質(zhì)譜(Nano-scale secondary ion mass spectrometry, nanoSIMS)技術(shù)的發(fā)展,使單細胞成像的方法得到補充。

拉曼光譜技術(shù)是根據(jù)原子質(zhì)量高的重同位素(如13C和15N)產(chǎn)生的拉曼光譜波長較輕同位素短,來分析微生物細胞的代謝功能。例如,當微生物利用13C標記的底物以后,一些生物標志物的拉曼波長變短,如核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類等[14]。此外,盡管每個物種均可以檢測到核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類等生物標志物,但是不同物種所產(chǎn)生圖譜的峰高有一定差異,因此,每個物種產(chǎn)生的拉曼圖譜不同,說明拉曼光譜技術(shù)還具有生成全細胞指紋圖譜(whole-organism fingerprints)的潛力[40]。

納米二次離子質(zhì)譜可以檢測任何穩(wěn)定性同位素和具有合適半衰期的任何放射性同位素,常用于分析生物樣品中的C、N、P、S、O、H 和鹵族元素等[41],得到復雜微生物群落中微生物細胞代謝活性的成像。此外,測定同位素的比值信息(例如13C/12C),可以用于計算單細胞的元素吸收速率,分析元素的代謝途徑[25],為環(huán)境中微生物的單細胞生態(tài)學和代謝潛力的研究打開了一個前所未有的窗口。該方法對同位素比值的分析具有非常高的靈敏度和準確度(理論上為1‰)[25,42],與其他單細胞的研究方法相比,具有非常高的優(yōu)勢。另外,納米二次離子質(zhì)譜與熒光原位雜交的方法相結(jié)合時,探針中的熒光標記由鹵素代替,即可在同一張圖像中同時顯示微生物的種類和功能[17],可以避免將熒光原位雜交的圖像與NanoSIMS 分析的圖像難以正確聯(lián)系起來的問題。

3 總結(jié)與展望

微生物在全球尺度上調(diào)控著生物地球化學循環(huán)過程,影響生態(tài)系統(tǒng)的功能。理解生態(tài)系統(tǒng)功能,從群落和單細胞水平揭示自然環(huán)境中微生物的種類和功能、微生物之間以及微生物與環(huán)境因子之間的相互作用是必不可少的。分子生物學方法的發(fā)展和進步為環(huán)境微生物的研究提供了方便,但是不同方法有其內(nèi)在的局限性(表1),在方法的選擇和應用上需根據(jù)研究具體情況進行選擇。例如,高通量測序、宏組學和單細胞水平研究的方法均是近些年快速發(fā)展的方法,與DGGE和T-RFLP等傳統(tǒng)方法相比,微生物的多樣性或功能基因的分析的廣度、深度和分辨率均有顯著提高,顯示出了其前所未有的優(yōu)勢和應用前景。然而,這些方法本身仍存在一些問題：(1)高通量測序得到的多為幾百個堿基或者更短的序列,組成完整的基因有一定困難；即使獲得整條序列,由于很多基因的功能還不清楚,很難獲得由序列到功能的準確圖譜；(2)單細胞水平研究方法中,Raman檢測到光譜偏移的同位素標記量需達到10 atom%[14]；FISH樣品的自發(fā)熒光易影響或掩蓋探針的熒光信號；樣品的制備過程中,固定和脫水等步驟也可能會影響微生物細胞的同位素組成[18]等。此外,基于PCR的方法,由于引物的選擇以及PCR本身的問題易對微生物的理解帶來偏差,如產(chǎn)生假序列(chimeras)(可通過生物信息學分析移除,如Bellerophon[49]、ChimeraSlayer[50]等軟件),另外,得到的信息主要以易于被PCR 擴增出的優(yōu)勢種群為主,而對環(huán)境中豐度較低的稀有微生物種群認識不足。未來的工作中,宏組學和單細胞水平研究的方法將有助于揭示自然環(huán)境中微生物整個群落的分類、功能信息以及豐度較低但發(fā)揮重要功能作用的微生物種群。由于目前用于闡明微生物群落組成和功能的方法均基于參考數(shù)據(jù)庫,這些參考數(shù)據(jù)庫主要是由克隆、Sanger測序或基因組等組成,即使新測序技術(shù)和單細胞水平技術(shù)有巨大的應用潛力,基于培養(yǎng)方法的研究依然要繼續(xù),如果沒有這些基礎數(shù)據(jù),不僅很多序列的功能都難以辨認,用于識別環(huán)境微生物種類或功能的核酸探針的準確性也受到限制。隨著微生物分子生物學方法(測序技術(shù)、單細胞水平研究技術(shù)等)的不斷改進和數(shù)據(jù)分析工具的不斷發(fā)展,對環(huán)境中微生物群落組成、微生物之間的相互作用的認識以及對生態(tài)系統(tǒng)的功能的理解也在不斷增加,為檢驗和構(gòu)思生態(tài)學理論提供新機遇[4],也為提出環(huán)境修復、自然生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)管理的新方法奠定基礎。

[1] Barnard R, Leadley P W, Hungate B A. Global change, nitrification, and denitrification: a review. Global Biogeochemical Cycles, 2005, 19(1): GB1007.

[2] Uhlik O, Leewis M C, Strejcek M, Musilova L, Mackova M, Leigh M B, Macek T. Stable isotope probing in the metagenomics era: a bridge towards improved bioremediation. Biotechnology Advances, 2013, 31(2): 154- 165.

[3] Mackelprang R, Waldrop M P, DeAngelis K M, David M M, Chavarria K L, Blazewicz S J, Rubin E M, Jansson J K. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature, 2011, 480(7377): 368- 371.

[4] Zimmerman N, Izard J, Klatt C, Zhou J Z, Aronson E. The unseen world: environmental microbial sequencing and identification methods for ecologists. Frontiers in Ecology and the Environment, 2014, 12(4): 224- 231.

[5] Epstein S S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology, 2013, 16(5): 636- 642.

[6] Tringe S G, Hugenholtz P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Current Opinion in Microbiology, 2008, 11(5): 442- 446.

[7] Nilsson R H, Ryberg M, Abarenkov K, Sj?kvist E, Kristiansson E. The ITS region as a target for characterization of fungal communities using emerging sequencing technologies. FEMS Microbiology Letters, 2009, 296(1): 97- 101.

[8] Kirk J L, Beaudette L A, Hart M, Moutoglis P, Klironomos J N, Lee H, Trevors J T. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods, 2004, 58(2): 169- 188.

[9] 邢德峰, 任南琪. 應用DGGE研究微生物群落時的常見問題分析. 微生物學報, 2006, 46(2): 331- 335.

[10] 余素林, 吳曉磊, 錢易. 環(huán)境微生物群落分析的T-RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施. 應用與環(huán)境生物學報, 2006, 12(6): 861- 868.

[11] Gentry T J, Wickham G S, Schadt C W, He Z, Zhou J. Microarray applications in microbial ecology research. Microbial Ecology, 2006, 52(2): 159- 175.

[12] Loman N J, Misra R V, Dallman T J, Constantinidou C, Gharbia S E, Wain J, Pallen M J. Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platforms. Nature Biotechnology, 2012, 30(5): 434- 439.

[13] Minoche A E, Dohm J C, Himmelbauer H. Evaluation of genomic high-throughput sequencing data generated on Illumina HiSeq and Genome Analyzer systems. Genome Biology, 2011, 12: R112-R112.

[14] Huang W E, Stoecker K, Griffiths R, Newbold L, Daims H, Whiteley A S, Wagner M. Raman-FISH: combining stable-isotope Raman spectroscopy and fluorescenceinsituhybridization for the single cell analysis of identity and function. Environmental Microbiology, 2007, 9(8): 1878- 1889.

[15] Pett-Ridge J, Weber P K. NanoSIP: NanoSIMS applications for microbial biology. Methods in Molecular Biology, 2012, 881: 375- 408.

[16] Eickhorst T, Tippkotter R. Improved detection of soil microorganisms using fluorescenceinsituhybridization (FISH) and catalyzed reporter deposition (CARD-FISH). Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(7): 1883- 1891.

[17] Li T L, Wu T D, Mazéas L, Toffin L, Guerquin-Kern J L, Leblon G, Bouchez T. Simultaneous analysis of microbial identity and function using NanoSIMS. Environmental Microbiology, 2008, 10(3): 580- 588.

[18] Peteranderl R, Lechene C. Measure of carbon and nitrogen stable isotope ratios in cultured cells. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2004, 15(4): 478- 485.

[19] Aronson E L, Dubinsky E A, Helliker B R. Effects of nitrogen addition on soil microbial diversity and methane cycling capacity depend on drainage conditions in a pine forest soil. Soil Biology and Biochemistry, 2013, 62: 119- 128.

[20] Cong J, Liu X D, Lu H, Xu H, Li Y D, Deng Y, Li D Q, Zhang Y G. Available nitrogen is the key factor influencing soil microbial functional gene diversity in tropical rainforest. BMC Microbiology, 2015, 15: 167- 167.

[21] Hermann-Bank M L, Skovgaard K, Stockmarr A, Larsen N, M?lbak L. The gut microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics, 2013, 14: 788- 801.

[22] Lu L, Jia Z J. Urease gene-containing Archaea dominate autotrophic ammonia oxidation in two acid soils. Environmental Microbiology, 2013, 15(6): 1795- 1809.

[23] Kim S J, Park S J, Cha I T, Min D, Kim J S, Chung W H, Chae J C, Jeon C O, Rhee S K. Metabolic versatility of toluene-degrading, iron-reducing bacteria in tidal flat sediment, characterized by stable isotope probing-based metagenomic analysis. Environmental Microbiology, 2014, 16(1): 189- 204.

[24] Clemmensen K E, Bahr A, Ovaskainen O, Dahlberg A, Ekblad A, Wallander H, Stenlid J, Finlay R D, Wardle D A, Lindahl B D. Roots and associated fungi drive long-term carbon sequestration in boreal forest. Science, 2013, 339(6127): 1615- 1618.

[25] Kuypers M M M, J?rgensen B B. The future of single-cell environmental microbiology. Environmental Microbiology, 2007, 9(1): 6- 7.

[26] Radajewski S, Ineson P, Parekh N R, Murrell J C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature, 2000, 403(6770): 646- 649.

[27] Cadisch G, Espana M, Causey R, Richter M, Shaw E, Morgan J A W, Rahn C, Bending G D. Technical considerations for the use of15N-DNA stable-isotope probing for functional microbial activity in soils. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005, 19(11): 1424- 1428.

[28] Schwartz E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(8): 2541- 2546.

[29] Putkinen A, Larmola T, Tuomivirta T, Siljanen H M P, Bodrossy L, Tuittila E S, Fritze H. Peatland succession induces a shift in the community composition ofSphagnum-associated active methanotrophs. FEMS Microbiology Ecology, 2014, 88(3): 596- 611.

[30] Dumont M G, Pommerenke B, Casper P. Using stable isotope probing to obtain a targeted metatranscriptome of aerobic methanotrophs in lake sediment. Environmental Microbiology Reports, 2013, 5(5): 757- 764.

[31] Lu Y H, Conrad R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science, 2005, 309(5737): 1088- 1090.

[32] 劉莉揚, 崔鴻飛, 田埂. 高通量測序技術(shù)在宏基因組學中的應用. 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2013, 8(3): 196- 200.

[33] Gerlach W, Jünemann S, Tille F, Goesmann A, Stoye J. WebCARMA: a web application for the functional and taxonomic classification of unassembled metagenomic reads. BMC Bioinformatics, 2009, 10: 430- 430.

[34] Meyer F, Paarmann D, D′Souza M, Olson R, Glass E M, Kubal M, Paczian T, Rodriguez A, Stevens R, Wilke A, Wilkening J, Edwards R A. The metagenomics RAST server-a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics, 2008, 9: 386- 386.

[35] Goecks J, Nekrutenko A, Taylor J, The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biology, 2010, 11(8): R86-R86.

[36] Reich M, Liefeld T, Gould J, Lerner J, Tamayo P, Mesirov J P. GenePattern 2.0. Nature Genetics, 2006, 38(5): 500- 500.

[37] Fierer N, Lauber C L, Ramirez K S, Zaneveld J, Bradford M A, Knight R. Comparative metagenomic, phylogenetic and physiological analyses of soil microbial communities across nitrogen gradients. The ISME Journal, 2012, 6: 1007- 1017.

[38] Xia Y, Wang Y B, Fang H H P, Jin T, Zhong H Z, Zhang T. Thermophilic microbial cellulose decomposition and methanogenesis pathways recharacterized by metatranscriptomic and metagenomic analysis. Science Reports, 2014, 4: 6708- 6708.

[39] Sorokin Y I. Radioisotopic Methods in Hydrobiology. Heidelberg: Springer, 1999.

[40] Huang W E, Griffiths R I, Thompson I P, Bailey M J, Whiteley A S. Raman microscopic analysis of single microbial cells. Analytical Chemistry, 2004, 76(15): 4452- 4458.

[41] Boxer S G, Kraft M L, Weber P K. Advances in imaging secondary ion mass spectrometry for biological samples. Annual Review of Biophysics, 2009, 38: 53- 74.

[42] Orphan V J, Turk K A, Green A M, House C H. Patterns of15N assimilation and growth of methanotrophic ANME- 2 archaea and sulfate-reducing bacteria within structured syntrophic consortia revealed by FISH-SIMS. Environmental Microbiology, 2009, 11(7): 1777- 1791.

[43] Musat N, Foster R, Vagner T, Adam B, Kuypers M M M. Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS. FEMS Microbiology Reviews, 2012, 36(2): 486- 511.

[44] Abraham W R. Applications and impacts of stable isotope probing for analysis of microbial interactions. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(11): 4817- 4828.

[45] Huang W E, Ferguson A, Singer A C, Lawson K, Thompson I P, Kalin R M, Larkin M J, Bailey M J, Whiteley A S. Resolving genetic functions within microbial populations: in situ analyses using rRNA and mRNA stable isotope probing coupled with single-cell raman-fluorescenceinsituhybridization. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(1): 234- 241.

[46] 胡行偉, 張麗梅, 賀紀正. 納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)(NanoSIMS)在微生物生態(tài)學研究中的應用. 生態(tài)學報, 2013, 33(2): 348- 357.

[47] Musat N, Halm H, Winterholler B, Hoppe P, Peduzzi S, Hillion F, Horreard F, Amann R, Jorgensen B B, Kuypers M M M. A single-cell view on the ecophysiology of anaerobic phototrophic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(46): 17861- 17866.

[48] Dekas A E, Poretsky R S, Orphan V J. Deep-sea archaea fix and share nitrogen in methane-consuming microbial consortia. Science, 2009, 326(5951): 422- 426.

[49] Huber T, Faulkner G, Hugenholtz P. Bellerophon: a program to detect chimeric sequences in multiple sequence alignments. Bioinformatics, 2004, 20(14): 2317- 2319.

[50] Haas B J, Gevers D, Earl A M, Feldgarden M, Ward D V, Giannoukos G, Ciulla D, Tabbaa D, Highlander S K, Sodergren E, Methé B, DeSantis T Z, The Human Microbiome Consortium, Petrosino J F, Knight R, Birren B W. Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons. Genome Research, 2011, 21(3): 494- 504.

Advances in molecular approach applications in microbial ecology studies

JI Hongfei1, 2, WANG Ying1,2,*

1StateKeyLaboratoryofSoilErosionandDrylandFarmingonLoessPlateau,InstituteofSoilandWaterConservation,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China2InstituteofSoilandWaterConservation,ChineseAcademyofSciencesandMinistryofWaterResources,Yangling712100,China

Microorganisms inhabit almost every imaginable environment and are important players in biogeochemical cycles. With the development and improvement of molecular biology-based approaches, the functions and community composition of microorganisms in ecosystems can be explored in more detail than ever before. Rapidly advancing molecular techniques have been applied to questions regarding microbial diversity, biogeography, and responses to environmental changes. Studies of microorganisms in the environment generally focus on three objectives—determining which microorganisms are present, what their functions are, and which are active at a given time. Comprehending the range of techniques currently available can be daunting. To facilitate the selection of the appropriate approach by researchers to study microbial communities in the environment, we introduce molecular methods according to microbial diversity and function, such as the rapidly developing high-throughput sequencing, meta-omics, and microbial single-cell approaches (e.g., nano-scale secondary ion mass spectrometry-fluorescenceinsituhybridization, NanoSIMS-FISH), and their applications in microbial ecology studies.

microbial diversity; microbial function; isotope labeling; high-throughput sequencing; metagenomics/metatranscriptomics; single-cell approaches

國家自然科學基金項目(41301322)；黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室基金項目(K318009902- 1303)；陜西省自然科學基金資助項目(2015JQ4111)

2015- 06- 04;

日期:2016- 04- 13

10.5846/stxb201506041132

*通訊作者Corresponding author.E-mail:yingwang@nwsuaf.edu.cn

姬洪飛, 王穎.分子生物學方法在環(huán)境微生物生態(tài)學中的應用研究進展.生態(tài)學報,2016,36(24):8234- 8243.

Ji H F, Wang Y.Advances in molecular approach applications in microbial ecology studies.Acta Ecologica Sinica,2016,36(24):8234- 8243.