李先文李玲林陽陽周棋贏李先維姚天澤陳宏敏

（1. 信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，信陽 464000；2. 信陽市中心醫(yī)院，信陽 464000；3. 信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，信陽 464000）

綜述與專論

植物細(xì)胞葉綠體的低溫反應(yīng)

李先文1李玲2林陽陽1周棋贏1李先維3姚天澤1陳宏敏1

（1. 信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，信陽 464000；2. 信陽市中心醫(yī)院，信陽 464000；3. 信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，信陽 464000）

低溫冷凍是亞熱帶至寒帶地區(qū)植物要經(jīng)受的一種主要環(huán)境脅迫，而生活于這些地區(qū)的越冬植物經(jīng)過長期進化已經(jīng)產(chǎn)生了適應(yīng)低溫環(huán)境的策略。近年來人們從生理到分子的多個水平對植物適應(yīng)低溫環(huán)境的策略進行了研究，對低溫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、冷誘導(dǎo)基因的類別和功能機制都有了一定的認(rèn)識。但是，對越冬植物細(xì)胞中葉綠體這一重要結(jié)構(gòu)在低溫下的生理活動特點和生存策略的認(rèn)識還不多。搜集整理了近年來的研究文獻中對葉綠體的低溫?fù)p傷、低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和低溫適應(yīng)策略的資料，以期助力于該領(lǐng)域的研究。

葉綠體；冷凍損傷；冷馴化；低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

地球陸地面積中有很多地區(qū)要長期或階段性的經(jīng)受零下低溫，低溫冷凍是分布于這些地區(qū)植物所要經(jīng)受的一種主要環(huán)境脅迫。經(jīng)過長期的進化，很多植物已產(chǎn)生了適應(yīng)長期或階段性低溫環(huán)境的生理機制。有關(guān)植物耐冷抗凍機理的研究現(xiàn)已積累了很多資料。例如，人們不僅了解到很多冷誘導(dǎo)基因、抗凍蛋白以及它們發(fā)揮作用的機理，還認(rèn)識了啟動冷誘導(dǎo)基因表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有依賴ABA和不依賴ABA（即ICE1-CBF途徑） 兩條，而且，冷誘導(dǎo)基因的表達存在著轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后等多個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)［1-3］。在這些冷反應(yīng)機制中，有關(guān)碳代謝、光合作用和生物膜脂類等的變化一直是人們關(guān)注的重點。

葉綠體（chloroplast）既是植物細(xì)胞進行光合作用的重要細(xì)胞器，還是蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂類、四吡咯化合物、萜類和酚類等多種物質(zhì)合成的場所，它在植物體乃至整個生物界的物質(zhì)和能量代謝中都發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而，很多環(huán)境因素（如低溫、干旱等）對葉綠體的生理活動都有影響，并由此進一步影響著植物體的生命活動。大量研究結(jié)果也顯示，葉綠體是植物細(xì)胞中對低溫最為敏感的結(jié)構(gòu)之一［4-7］，所以，研究冬季植物的葉及其葉綠體的生理生化變化對于闡明葉的低溫反應(yīng)特性和抗寒機理以及作物抗低溫育種等都有重要意義，在解決農(nóng)林生產(chǎn)實際問題上也有廣泛的應(yīng)用價值。但是，迄今尚缺少針對葉綠體低溫反應(yīng)與損傷方面的綜述，本文對該領(lǐng)域的研究資料進行梳理，以期為該方向的深入研究理清思路。

1 低溫對植物細(xì)胞葉綠體的傷害

高等植物細(xì)胞的葉綠體多沿細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)排布，其大小和數(shù)量常因物種不同而異，但其結(jié)構(gòu)在常溫下卻是相對穩(wěn)定的，多呈橢圓形，表面光滑，有的外膜上有向外突起形成的小泡，其內(nèi)基粒片層緊密垛疊，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。而低溫常引起葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能等方面的損害［6，7］。多數(shù)重要的一年生農(nóng)作物如水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、棉花（Gossypium hirsutum）、黃瓜（Cucumis sativus）和番茄等都是冷敏性的，當(dāng)它們處于10℃以下低溫時，植株會不同程度地受到傷害，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，番茄幼苗經(jīng)5℃處理2 h，其子葉細(xì)胞內(nèi)的葉綠體被膜及類囊體膜即發(fā)生斷裂；棉花、黃瓜經(jīng)低溫后，細(xì)胞內(nèi)葉綠體多整體變圓或成弓形，其被膜受損，嚴(yán)重時會變得模糊不清，有些葉綠體甚至解體或幾個變態(tài)葉綠體相互粘連堆疊在一起，其內(nèi)基粒的類囊體數(shù)目顯著減少，排列紊亂，甚至完全消失。伴隨著葉綠體形態(tài)的改變，葉片的光合速率顯著降低［8，9］。落葉木本植物（如構(gòu)樹，paper mulberry）若經(jīng)較長時間冷脅迫時（4℃、48 h），葉邊緣即開始枯萎，而其細(xì)胞的原生質(zhì)膜發(fā)生內(nèi)陷，葉綠體形狀逐漸由原來的梭形膨脹為紡錘形或橢圓形，膜性結(jié)構(gòu)明顯損傷，類囊體堆積很少，典型的基粒消失［7］。而當(dāng)越冬植物在超過其葉細(xì)胞耐受的低溫及凍融循環(huán)時，其葉綠體被膜也常遭損壞、內(nèi)陷破裂，基粒松散至排列紊亂，甚至整個葉綠體破裂解體［5，10］。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，茶葉細(xì)胞的葉綠體在1-25℃下，形態(tài)基本上無變化，但經(jīng)-20℃低溫處理2 h后，即發(fā)生斷裂和空泡化（資料尚未發(fā)表）。低溫可引起植物細(xì)胞葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，這一特點已成為人們比較普遍接受的評定植物抗寒性的一個重要指標(biāo)。

大量實驗證明，低溫常引起植物細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生相變，膜上產(chǎn)生龜裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的區(qū)隔化削弱甚至消失，引起其功能障礙或代謝紊亂。由于葉綠體內(nèi)有大量的類囊體，使其成為細(xì)胞內(nèi)易受低溫傷害的結(jié)構(gòu)，如黃瓜和番茄在5℃時光合速率明顯下降；菠菜在遭受凍害時，其葉綠體膜結(jié)構(gòu)的半透性消失，光合磷酸化解偶聯(lián)。葉綠體對低溫敏感的另一個更重要原因是其很多蛋白質(zhì)對低溫敏感，例如：（1）經(jīng)5℃處理的番茄幼苗葉細(xì)胞中，伴隨其葉綠體被膜和類囊體膜的斷裂，其類囊體膜上的Mg2+-ATP酶活性明顯減弱；遭受凍害的菠菜其類囊體膜上的偶聯(lián)因子（CF1）、捕光天線LHCⅡ蛋白、33 kD錳穩(wěn)定蛋白和反應(yīng)中心D1蛋白等大量減少或解離，導(dǎo)致其不能有效地吸收和利用光能［6，11］；水稻寒害脅迫時幾種蛋白降解加劇，尤其是光合蛋白，如Rubisco的大亞基［12］。（2）很多葉綠體蛋白［如光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅠ和PSⅡ）、捕光天線LHCⅡ蛋白和Rubisco等］編碼基因的表達也易被低溫抑制，造成其光合酶的減少、活性顯著降低和修復(fù)障礙，致使其光合作用活性下降［13］。Rubisco的活性與RuBP再生能力和CO2的同化速率密切相關(guān)，其酶蛋白的兩種亞基分別由葉綠體基因和核基因編碼。實驗顯示，油菜（Brassica napus）的Rubisco小亞基蛋白基因的表達和蛋白豐度在冷脅迫后都被下調(diào)。而且，葉綠體自身編碼蛋白對低溫的敏感性比核編碼的葉綠體蛋白的低溫敏感性要高［14，15］。（3）Dutta等［4］還發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫時，由ATP驅(qū)動的Rubisco小亞基蛋白前體（PRSS）是由ATP驅(qū)動的輸入質(zhì)體的速率被下調(diào)了，而且該過程是由于葉綠體的被膜蛋白Tic110和Tic40功能下調(diào)所致。

綜上所述，葉綠體的寒凍損傷可能首先損害的是葉綠體的膜結(jié)構(gòu)（包括類囊體膜），并使膜上的功能性蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)型改變，引起酶活性降低，并使整個細(xì)胞內(nèi)的ATP含量急劇減少，從而降低其生物合成速率，引起細(xì)胞生理功能紊亂。若寒凍傷害時間較短，傷害是可逆的，反之，隨破壞程度的加深會導(dǎo)致死亡。

2 植物細(xì)胞葉綠體對低溫的適應(yīng)性反應(yīng)

越冬植物在經(jīng)受低溫馴化后，都能增強其耐凍性。經(jīng)過大量的研究，人們對越冬草本和常綠木本植物葉及葉綠體的冷適應(yīng)反應(yīng)已有所認(rèn)識，可歸納如下：（1）越冬葉片的重要生理特征是其生物膜中不飽和脂肪酸的含量增加，使其在低溫下仍可保持液晶態(tài)而行使其正常生理功能，使細(xì)胞的區(qū)域分隔在所要求范圍內(nèi)得到保持。多不飽和脂肪酸（如三烯脂肪酸：16∶3/18∶3）含量的多寡與不同品種的抗凍性及其低溫下光抑制的程度和恢復(fù)速度密切相關(guān)［16，17］。在光合膜中，膜脂（約占膜干重的50%左右）的組成明顯地不同于細(xì)胞膜、液泡膜等其他膜結(jié)構(gòu)，而以糖脂含量最多，約為膜脂總量的70%（摩爾百分比）以上。光合膜中的糖脂主要為雙半乳糖二酰基甘油（DGDG）和單半乳糖二?；视停∕GDG）。當(dāng)含多不飽和脂肪酸鏈（如亞麻酸）時可使MGDG和DGDG的相變溫度分別降為-30℃和-50℃。由于膜相變會導(dǎo)致鑲嵌于脂質(zhì)中的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，引起膜上一些酶系統(tǒng)功能的變化，因此，類囊體膜的穩(wěn)定性不僅決定逆境中植物的光合效率，還具有逆境信號的放大作用。人們對擬南芥的Fad7和Fad8基因（編碼兩種葉綠體脂肪酸去飽和酶）的實驗研究早已證明了生物膜的液晶態(tài)對 于植物在零下低溫環(huán)境中的生存是至關(guān)重要的，而其脂組分中亞麻酸優(yōu)先累積似乎是抗寒植物之所以具有較高抗寒力的普遍機制之一［18-20］。（2）植物經(jīng)冷馴化后，膜脂組分除不飽和度的增加外，并伴有膜上蛋白質(zhì)種類和含量的變化，其中類囊體的脂類/蛋白質(zhì)比率在冷馴化后升高，而類囊體膜中還有一些典型的冷誘導(dǎo)蛋白已被證明在葉綠體的冷適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。例如：耐冷植物葉綠體的H+-ATPase都保持著較高活性，從而保證葉綠體中有充足的ATP供應(yīng)，使葉綠體編碼蛋白的合成和核編碼類囊體蛋白的轉(zhuǎn)入和定位組裝等過程能夠順利完成；組成光系統(tǒng)I（PSI）的PSI-E和PSI-N亞基、光系統(tǒng)II（PSII）的D1和D2蛋白、兩個PsbP家族蛋白（29.8 kD和20 kD蛋白）和質(zhì)體藍素（PC）分子等在低溫下更換速率加快，從而保證電子流動的順利進行，增進植物對低溫的適應(yīng)［15，21］。（3）脫水素具有高度的親水性和熱穩(wěn)定性，在低溫脅迫時，它們積累在膜下像粘膠拉鏈一樣結(jié)合于大分子表面，以保護大分子的結(jié)構(gòu)和活性，還可使失活的酶類恢復(fù)活性，從而對膜及其鑲嵌蛋白活性的維持也有十分重要的作用［22，23］；最近，Singh等［24］研究發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于從藍細(xì)菌到植物葉綠體中的一個與抗逆性和抗病性相關(guān)的大蛋白家族——原纖維蛋白［Fibrillins，與光系統(tǒng)II捕光色素復(fù)合體和質(zhì)體球滴結(jié)構(gòu)（Plastoglobules）結(jié)合在一起］是多種脅迫（低溫、光氧化、干旱和滲透）抗性所必需的成分，可保持質(zhì)體球滴結(jié)構(gòu)的完整性和光合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。E. PSII Z蛋白的減少會導(dǎo)致活性天線減少，使流向PSII的電子減少，從而減輕光合電子傳遞鏈的氧化壓力，這是低溫時通過降低Z蛋白基因的表達量來實現(xiàn)的［15］。在茶葉等植物中存在著葉綠體發(fā)育和形態(tài)建成響應(yīng)低溫的白化葉現(xiàn)象（如白茶和小麥的白化苗等）是這類形態(tài)學(xué)上的典型例證。另外，Ndong等［25］發(fā)現(xiàn)了一組存在于禾谷類作物葉綠體基質(zhì)中的晚成熟蛋白（LEA）3-L1、（LEA）3-L2和（LEA）3-L3是WCS19的同源物，其中的（LEA）3-L2與不同小麥（Triticum aestivum）和黑麥（Secale cereale）栽培種抗凍性的增強相關(guān)；還發(fā)現(xiàn)若用Wcs19基因轉(zhuǎn)化擬南芥，可使轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性顯著增強。（3）保持自由基的代謝平衡是葉綠體適應(yīng)低溫的重要機制。植物的葉綠體、線粒體和過氧化物酶體在生命活動中都會產(chǎn)生超氧化物與過氧化氫等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），尤其是當(dāng)植物處在自然界廣泛存在的各種逆境條件都會導(dǎo)致植物體內(nèi)ROS代謝失衡，數(shù)量增加。由于低溫條件下植物所接收的光能超出其光化學(xué)同化能力，葉綠體就成了植物細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要場所。所以，冷敏感植物和未經(jīng)冷馴化的耐冷植物的PSII的D1和D2蛋白在低溫侵襲時易遭光氧化損傷。而經(jīng)冷馴化后的抗凍植物改變了基因的表達模式，引發(fā)了體內(nèi)的一系列光保護反應(yīng)，從光能的吸收（活性天線減少）、電子的傳遞（細(xì)胞色素b6f復(fù)合體、PC等活性的調(diào)節(jié)和電子傳遞鏈更換速率的加快）、過剩還原力的耗散等多個環(huán)節(jié)來增強植物的冷適應(yīng)，減少ROS產(chǎn)生的量。而一旦ROS產(chǎn)生的量增多，還可激活“蘋果酸閥”，將過量的還原力轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中利用［26，27］。

盡管光保護的方式多種多樣，而清除自由基的酶［如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）和過氧化物酶（POD）］和抗氧化劑（如抗壞血酸、谷胱甘肽、類胡蘿卜素和維生素E等）等也是其非常關(guān)鍵的防線［26，28］。在一個成熟的葉肉細(xì)胞中，大約有30%-40%的抗壞血酸（ASA），10%-50%的谷光甘膚（GSH），全部的維生素E（VE）及全部的類胡蘿卜素（CAR）都存在于葉綠體中。在葉綠體基質(zhì)中，ASA濃度可高達50 mmol/L，GSH可達10 mmol/L；在類囊體膜上，VE與葉綠素分子的比值約為1∶24，用以防護膜系統(tǒng)成分的氧化，VE的高脂溶性還能增強膜流動性，從而提高PSⅡ的光化學(xué)活性。ASA不僅是ROS清除劑，還可偶聯(lián)產(chǎn)生跨膜△pH，促進葉黃素循環(huán)。葉綠體中含有大量的VC和GSH，對H2O2和O2-的清除有重要作用。玉米等一些植物對冷害的抵抗能力較差，原因之一就是清除活性氧的機制較差。耐冷植物的葉綠體可使ROS濃度保持在較低水平，對茶樹的研究發(fā)現(xiàn)，抗凍性強的品種超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性在低溫時能維持較高的水平；過氧化物酶同工酶總活性及譜帶數(shù)量明顯強于和多于抗性弱的品種［15，24，29，30］。

3 葉綠體在植物冷馴化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用

高等植物的葉綠體含有3 000多種蛋白質(zhì)，絕大多數(shù)是由核基因編碼的［31］。葉綠體對環(huán)境變化的適應(yīng)可反應(yīng)在相應(yīng)核基因的表達水平上，而質(zhì)體到核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)著這類基因的表達。在冷馴化過程中，植物抗凍性的發(fā)展與其光合作用活性密切相關(guān)。植物能感知日長、光質(zhì)和光照強度。葉綠體既以日光作為能源，并可通過調(diào)節(jié)代謝來適應(yīng)電子傳遞鏈的氧化還原狀態(tài)，并由此適應(yīng)光照強度的變化［32］。PSⅡ激發(fā)壓的增加是冷調(diào)節(jié)基因表達的原初刺激，因此，暴露于冷環(huán)境時如果沒有光照也會降低很多冷調(diào)節(jié)基因的誘導(dǎo)［31，33］。同樣，一些與冷馴化相關(guān)的形態(tài)學(xué)特征（如冬季谷物緊湊蓮座的生長習(xí)性的發(fā)展）是依賴PSII激發(fā)壓的［34］。當(dāng)擬南芥和其他植物在黑暗、低光強度、或在正常光強度但有光合作用抑制劑3-（3，4-二氯苯基）-1-二甲基脲存在的條件下冷馴化時檢測不到抗凍性的增加［35］。Svensson等［36］通過利用基因芯片技術(shù)對大麥（Hordeum vulgare）葉綠體發(fā)育缺陷突變體的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)僅有11%的冷調(diào)節(jié)基因是不依賴葉綠體的，這類基因主要包括很多CBF（C-repeat binding factor）控制的基因；而大約67%的冷調(diào)節(jié)基因是依賴葉綠體的，從而證明葉綠體在控制植物的冷馴化中發(fā)揮著主要作用。

在低溫條件下，葉綠體的光合能力降低，導(dǎo)致其ROS的積累。ROS是植物體內(nèi)重要的信號分子，可作為第二信使引發(fā)葉綠體到細(xì)胞核的信號反饋，并改變很多基因的表達模式，使其光合作用活性和細(xì)胞代謝達到平衡狀態(tài)。這說明光合電子傳遞鏈（photosynthetic electron transport chain，PET） 的任何平衡失調(diào)都會導(dǎo)致氧化還原作用的失衡，植物體由此通過葉綠體來實現(xiàn)感知環(huán)境溫度的降低，產(chǎn)生質(zhì)體到細(xì)胞核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。因此，涉及PET蛋白（如FtsHs和Deg蛋白酶）的核基因突變都會導(dǎo)致氧化還原失衡和發(fā)育異常。葉綠體基因的表達狀態(tài)充當(dāng)著另一個PET平衡的檢驗點，很多基因（如Wcs19和早期光誘導(dǎo)蛋白基因等）的表達影響著PSⅡ的激發(fā)壓和PET的平衡［25，27］。Lepage等［6］對擬南芥的研究表明，質(zhì)體基因組的不穩(wěn)定會導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生和質(zhì)體到細(xì)胞核的信息反饋。葉綠體基質(zhì)中NADP/NADPH的比率是其氧化還原電位的反映［24，26，37，38］。除葉綠體的光合組件和其他分子的氧化還原狀態(tài)等引起活性氧的積累信號外，人們還認(rèn)識到葉綠素生物合成的中間體（如四吡咯類化合物）和糖的積累等都可以提供核編碼的質(zhì)體蛋白和非質(zhì)體蛋白基因表達調(diào)節(jié)的信號［31，32，39］。

4 結(jié)語

葉綠體不僅是植物細(xì)胞中對低溫非常敏感的細(xì)胞器，易受冷凍傷害，它在植物細(xì)胞的低溫信號感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)中也發(fā)揮著很重要的作用。目前，有關(guān)葉綠體的低溫傷害、適應(yīng)性反應(yīng)和參與的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還遠(yuǎn)未闡明。而這一領(lǐng)域的研究有著誘人的前景，故有人暢想，操縱光保護反應(yīng)將提高植物的光合作用，這會給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的效益［26，38，40］。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Responses of Chloroplasts of Plant Cells to Cold

LI Xian-wen1LI Ling2LIN Yang-yang1ZHOU Qi-ying1LI Xian-wei3YAO Tian-ze1CHEN Hong-min1
（1. College of Life Science of Xinyang Normal University，Xinyang 464000；2. The Central Hospital of Xinyang City，Xinyang 464000；3. Affiliated Hospital of Xinyang Vocational and Technical College，Xinyang 464000）

Freezing is a major environmental stress to the plants growing from subtropical regions to frigid areas，and the plants have successfully evolved the strategy to vurvive the low temperature encountered. In recent years，the cold-adaptation strategy of plants has been widely studied at physiological and molecular levels i.e.，there have been certain understandings on the cold signal transduction network，types and fucntions of cold-induced genes. But the physiological characteristics and survival strategies of chloroplasts in overwintering plant during cold stress，still largely remain unknown. In the current review，we collected and compiled the reported information on the cold damages，cold-signal transduction and cold-adaptation strategy of plant chloroplasts，aiming at being conducive to the researches of this field.

chloroplast；freezing injury；cold acclimation；cold signal transduction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.001

2016-01-11

國家自然科學(xué)基金項目（31270727，U1404319）

李先文，男，博士，教授，研究方向：植物脅迫生理學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：xianwenli01@sina.com