毛迎李超婧王富軍丁雯米杏妍王璐

201620上海，東華大學(xué)紡織學(xué)院，紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

PEG對(duì)肝素化PCL/PEG人工血管膜材料中肝素釋放的影響

毛迎李超婧王富軍丁雯米杏妍王璐

201620上海，東華大學(xué)紡織學(xué)院，紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的研究聚乙二醇（PEG）的加入對(duì)肝素化聚己內(nèi)酯/聚乙二醇（PCL/PEG）人工血管膜材料中肝素體外釋放的影響。方法通過共混法和冷凍干燥技術(shù)制備不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜材料，并通過體外釋放實(shí)驗(yàn)考察PEG的加入對(duì)肝素釋放性能的影響。同時(shí)，通過X射線衍射、傅里葉紅外光譜和差示掃描熱分析儀探究PEG的加入對(duì)基體結(jié)構(gòu)性能的影響。結(jié)果PEG的加入降低了肝素從基體釋放的難度，提高了肝素第1天的平均釋放速率和34 d內(nèi)的累積釋放率，且兩者在一定程度上隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大。X射線衍射、傅里葉紅外光譜和差示掃描熱分析結(jié)果均表明，肝素的加入會(huì)使PCL膜的結(jié)晶度在一定程度上有所增大，但整體影響并不顯著，且肝素的加入會(huì)促進(jìn)PEG晶粒的生長，肝素和PEG在基體中呈現(xiàn)共域化分布。結(jié)論利用共混法和冷凍干燥技術(shù)制備了肝素化PCL/PEG膜材料，并可通過調(diào)控PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定程度上實(shí)現(xiàn)對(duì)肝素釋放行為的控制，進(jìn)而預(yù)測試樣在一定程度上具有抗凝作用，該材料有望用作小口徑人工血管膜材料。

肝素化；共混；藥物緩釋；血管膜材料

Fund program:Natural Science Foundation of China(81371648);Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(2016);Project 111(B07024);National Postdoctoral Foundation(2016M590299);Science and Technology Support Program of Shanghai(16441903803)

0 引言

20世紀(jì)60年代起,研究者開始利用肝素化來提高材料的抗凝血性[1]，目前肝素化研究仍是一個(gè)很熱門的方向。肝素化的定義可概括為肝素或其衍生物在材料上的固定化[2]，它是提高材料血液相容性的重要方式。臨床上通常采用肝素注射的方法來提高抗凝血性，但注射肝素會(huì)引起各種并發(fā)癥，從而限制了一些臨床上高難度手術(shù)的進(jìn)行。然而，肝素化的推廣在一定程度上解決了以上問題。目前，許多學(xué)者已成功實(shí)現(xiàn)了肝素分子在生物材料表面上的固定化，從而大大提高了血液接觸材料的抗凝血性能[3-6]。肝素化的方法有很多，按其固定化力的性質(zhì)，可分為物理吸附[7]和化學(xué)結(jié)合兩大類,而化學(xué)結(jié)合又可進(jìn)一步分為離子鍵合法和共價(jià)鍵合法[8]。雖然肝素以共價(jià)鍵和離子鍵的形式結(jié)合到血管移植物的管腔內(nèi)表面，一定程度上阻止了血栓的形成，但仍存在一些問題。共價(jià)鍵的結(jié)合方式可牢固地將肝素固定在材料表面，但會(huì)破壞肝素的功能構(gòu)象，導(dǎo)致抗凝功能發(fā)揮不充分；而離子鍵的結(jié)合方式雖保證了肝素功能的發(fā)揮，但其結(jié)合能力較弱，難以實(shí)現(xiàn)長期抗凝的功能。相對(duì)來說，共混法是實(shí)現(xiàn)材料肝素化的最簡單方法，且該法既不會(huì)破壞肝素的共價(jià)鍵，也不易導(dǎo)致肝素失效；但會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)肝素或其衍生物被包埋在材料內(nèi)部而不能發(fā)揮作用[9]，故如何解決肝素的釋放成為了研究的關(guān)鍵。本研究利用共混法和冷凍干燥技術(shù)制備了肝素化聚己內(nèi)酯/聚乙二醇（ploy（ε-caprolactone）/polyethylene glycol,PCL/PEG）膜材料，探究了不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肝素化PCL/PEG膜材料的藥物釋放性能，并采用多種表征手段對(duì)其結(jié)構(gòu)性能進(jìn)行了一系列的表征，進(jìn)一步分析PEG的加入對(duì)肝素化PCL/PEG膜材料中肝素釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

肝素（效價(jià)≥170 U/mg）、PEG（相對(duì)分子質(zhì)量為4 000 u）、乙酸（分析純）、甲苯胺藍(lán)（相對(duì)分子質(zhì)量為305.8）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），PCL（相對(duì)分子質(zhì)量為80 000 u）（深圳市光華偉業(yè)實(shí)業(yè)有限公司）。

X85-2S恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司），F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），TS-100C恒溫?fù)u床（上海柏欣儀器設(shè)備廠），TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），D/max-2550PC X射線多晶衍射儀（日本Rigaku公司），Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），DSC4000差示掃描熱分析儀（美國PerkinElmer公司）。

1.2 方法

1.2.1 肝素化PCL/PEG膜的制備

將總質(zhì)量為2.2 g的PCL和PEG按一定質(zhì)量比溶于22 ml乙酸中，磁力攪拌，完全溶解后向其中加入2.2 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的肝素水溶液，混勻并將其倒入干凈的玻璃皿中，冷凍干燥后得不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜。

1.2.2 體外緩釋

準(zhǔn)確稱取0.5 g肝素化PCL/PEG膜，將其放入含150 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的白口瓶中；將白口瓶放入恒溫?fù)u床中，搖床溫度設(shè)為37℃，轉(zhuǎn)速設(shè)為120 r/min；分別于1、4、8、24 h（1 d）、96 h（4 d）、192 h（8 d）、312 h（13 d）、456 h（19 d）、624 h（26 d）和816 h（34 d）時(shí)從白口瓶中抽取2．5 ml浸提液，按對(duì)應(yīng)的編號(hào)做好標(biāo)記，再補(bǔ)充2.5mlPBS至白口瓶中；根據(jù)甲苯胺藍(lán)分光光度法[10]，分別向浸提液中加入2.5 ml甲苯胺藍(lán)溶液后置于恒溫?fù)u床中，37℃反應(yīng)0.5 h，使肝素鈉與甲苯胺藍(lán)反應(yīng)形成配合物；再加入2 ml正己烷，充分振蕩1 min，將配合物萃取至有機(jī)層，未絡(luò)合的甲苯胺藍(lán)則仍留在水相中；取下層水相，使用分光光度計(jì)測其在631 nm處的吸光度值，進(jìn)一步分析獲得不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的浸提液中肝素鈉的含量。

1.2.3 測試與表征

（一）X射線衍射分析

使用X射線多晶衍射儀分別測定PCL/PEG膜、肝素和肝素化PCL/PEG膜的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。衍射源為Cu/K-α1，電壓為40 kV，電流為200 mA，掃描速度為3°/min，掃描范圍為5°～60°。

（二）傅里葉變換紅外光譜分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀分別對(duì)肝素、PCL膜、PCL/PEG膜和肝素化PCL/PEG膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較和表征，波數(shù)掃描范圍為500～4 000 cm-1。

（三）差示掃描熱分析

采用差示掃描熱分析儀對(duì)不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試樣進(jìn)行測試。單次測試樣品質(zhì)量為5 mg，氣氛為氮?dú)?，?降溫速率為10℃/min，溫度掃描范圍為-30～80℃。

圖2 不同聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肝素化聚己內(nèi)酯/聚乙二醇膜的肝素釋放特征圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外釋放

不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜的肝素釋放曲線和特征圖分別如圖1和2所示。由圖1、2可看出，不添加PEG時(shí)，肝素被包裹在PCL基體內(nèi)難以釋放出來；4 d內(nèi)肝素的累積釋放率基本不發(fā)生變化，后期隨著PCL基體的溶脹，肝素漸漸釋放出來，但34 d內(nèi)肝素的累積釋放率＜15%。當(dāng)加入PEG之后，第1天的肝素平均釋放速率和34 d內(nèi)的肝素累積釋放率均大幅提高（均P＜0.001）；在一定范圍內(nèi)，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，肝素第1天的平均釋放速率和34 d內(nèi)的累積釋放率均逐漸增加。此外，由于PCL膜材料疏水且降解較慢，在釋放第1天，被包裹在膜內(nèi)的肝素隨著PEG的溶出而產(chǎn)生突釋；在第2～8天，加入PEG的共混膜中幾乎無肝素釋放出來，推測PEG在第1天即已從共混膜中完全溶出，且8 d內(nèi)PCL膜在中性環(huán)境中可能還未發(fā)生降解；后來隨著浸提液侵入PCL基體內(nèi)部，材料發(fā)生溶脹，肝素才漸漸釋放出來，預(yù)計(jì)隨著材料的降解肝素能在后期被緩慢釋放出來。

2.2 X射線衍射分析

圖3為肝素化PCL/PEG膜材料的X射線衍射圖。由圖3可知，低相對(duì)分子質(zhì)量的肝素為完全非結(jié)晶的物質(zhì)；在19°附近是PEG的特征衍射峰[11]，峰值較小但峰形尖銳，21°附近是PCL的特征衍射峰[12]，峰值高而峰形尖銳，24°附近是PEG和PCL特征衍射峰的疊加。此外，PCL/PEG膜的結(jié)晶度為73.57%，而肝素化的PCL/PEG膜的結(jié)晶度為79.65%，可推斷肝素的加入對(duì)試樣結(jié)晶度的提升并不顯著。但是，從19°附近PEG的特征衍射峰可看出，加入肝素后，試樣的峰值變強(qiáng)，這說明肝素的加入能促進(jìn)PEG晶體的生長；從側(cè)面也反映出肝素和PEG在PCL基體中呈現(xiàn)共域化分布的趨勢[13]，而這種分布有利于肝素從基體中被釋放出來。

2.3 傅里葉紅外光譜分析

圖4和圖5分別為肝素化PCL膜和PCL/PEG膜材料的傅里葉紅外光譜圖。研究結(jié)果顯示，肝素在3 450 cm-1和1 620 cm-1附近具有明顯的特征峰，其中3 450 cm-1附近的特征峰分布較寬；PCL膜在3 000 cm-1和1750 cm-1附近具有明顯的特征峰，其中1750cm-1附近的特征峰非常尖銳；在PCL膜中加入肝素后，試樣的特征峰在3 450 cm-1和1 620 cm-1附近略有變化，其他特征峰位置基本無變化，但試樣的峰強(qiáng)度有所增強(qiáng)；而在PCL膜中加入PEG則使試樣的峰強(qiáng)度變大，但變化不太明顯；當(dāng)在PCL膜中同時(shí)加入PEG和肝素時(shí)，試樣的峰強(qiáng)度明顯增大，結(jié)合X射線衍射的分析結(jié)果可推斷肝素對(duì)PEG的結(jié)晶具有一定的促進(jìn)作用。

2.4 差示掃描熱分析

不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肝素化PCL/PEG膜的差示掃描熱分析結(jié)果如圖6所示。PCL膜的熔融溫度在60℃左右；當(dāng)PCL膜中加入PEG后，熔融峰值向高溫偏移，能稍微提高PCL膜的熔融溫度，但熔融峰面積明顯減小，說明PEG的加入在一定程度上可使PCL膜的結(jié)晶度降低；當(dāng)PCL膜中混入肝素時(shí)，PCL膜的熔融峰變得很寬，幾乎出現(xiàn)了雙峰值，且熔融溫度降低；當(dāng)肝素化PCL/PEG膜中PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至15%時(shí)，熔融性能又恢復(fù)。這說明肝素的加入對(duì)基體的結(jié)晶性能具有一定的影響，而PEG的加入可在一定程度上降低肝素對(duì)PCL膜結(jié)晶性能的改變?？傊?，PEG的加入在一定程度上降低了肝素從試樣中的釋放難度。

3 討論與結(jié)論

肝素是一類重要的抗凝血藥物，應(yīng)用于臨床已有80多年[14-15]。肝素主要由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成，其分子中含有兩類活性基團(tuán),分別是—SO3-及—COO-等負(fù)離子和—OH及—NH—等官能團(tuán)[9,16]。其中，負(fù)離子上的抗衡離子可進(jìn)行離子交換；而—OH及—NH—上的氫能發(fā)生一系列的功能性反應(yīng)。因此，利用離子交換反應(yīng)及活潑氫原子的反應(yīng)可將肝素分別以離子鍵和共價(jià)鍵固定在高分子的主鏈或側(cè)鏈上，實(shí)現(xiàn)本體材料的肝素化，但這或多或少會(huì)破壞肝素的活性。將肝素或其衍生物直接混入高分子材料中是實(shí)現(xiàn)材料肝素化的最簡單方法，且不會(huì)破壞肝素的活性，但該法會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)肝素或其衍生物被包埋在材料內(nèi)部而不能發(fā)揮其作用[9]，故如何解決肝素的釋放成了研究的關(guān)鍵。

本研究通過簡單的共混法和冷凍干燥技術(shù)將具有天然抗凝性的肝素鈉引入PCL/PEG材料中，得到了一種肝素化PCL/PEG膜材料。研究結(jié)果顯示，PEG的加入降低了肝素從基體釋放的難度，提高了肝素第1天的平均釋放速率和34 d內(nèi)的累積釋放率，且兩者在一定程度上隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大。PEG具有良好的水溶性，當(dāng)其與體液接觸時(shí)易于從基體中溶出，從而為肝素的釋放提供了通道；同時(shí)，肝素和PEG在基體中呈現(xiàn)一種共域化分布，這些對(duì)肝素從基體中的釋放均是有利的?？傊狙芯坷霉不旆ê屠鋬龈稍锛夹g(shù)制備了肝素化PCL/PEG膜材料，并可通過調(diào)控PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定程度上實(shí)現(xiàn)對(duì)肝素釋放性能的控制，進(jìn)而預(yù)測試樣在一定程度上具有抗凝作用，該材料有望用作小口徑人工血管膜材料。

利益沖突無

（圖1、3～6見插頁6-11）

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Influence of PEG on heparin release of heparin-loading PCL/PEG vascular prosthesis membranes

Mao Ying,Li Chaojing,Wang Fujun,Ding Wen,Mi Xingyan,Wang Lu
Textile College,Key Laboratory of Textile Technology,Ministry of Education of China,Donghua University,Shanghai 201620,China

ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofpolyethyleneglycol(PEG)onheparinreleaseofheparinloaded polycaprolactone/polyethylene glycol(PCL/PEG)membranes used in artificial vascular peosthesis.Methods Heparin-loaded PCL/PEG membrane samples with different PEG mass contents of 0,0.5%,10%and 15%were prepared by blending method and freeze-drying technology.The influence of PEG on heparin release was experimental studied in vitro.The influence of PEG on the structural characteristics of the samples were investigated by X-ray diffraction,Fourier transform infrared spectrum and differential scanning calorimeter.ResultsThe addition of PEG reduced the heparin release resistance.The results showed that the average release rate of heparin in the first day and the release amount for 34 d were improved.Both these parameters increased with the increase of PEG mass content.The X-ray diffraction,Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed that the crystallinity of PCL membrane was slightly enhanced by the addition of heparin,but the overall effect was not significant.In addition,the addition of heparin could promote the crystalline grain growth of PEG,and a common distribution of heparin and PEG in the matrix was observed.ConclusionsThe heparin release control can be achieved by adjusting the PEG mass content in heparin-loading PCL/PEG membranes prepared by blending method and freeze-drying technology.The proposed samples may have anticoagulant effect,which can be expected to be used as small-diameter artificial vascular prosthesis material.

Heparinization;Blending;Sustained release;Vascular membrane material

s:Wang Fujun,Email:wfj@dhu.edu.cn;Wang Lu,Email:wanglu@dhu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金（81371648）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)基地項(xiàng)目（2016）；“111計(jì)劃”（B07024）；中國博士后科學(xué)基金（2016M590299）；上海市科技支撐項(xiàng)目（16441903803）

2016-07-11）

王富軍，Email:wfj＠dhu．edu．cn；王璐，Email:wanglu＠dhu．edu．cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．007