榮廣健，張佑紅，諶　頡，黃　萌，周　鋒，胡　凱

(武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

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恒定pH值對粘質沙雷氏菌產靈菌紅素的影響

榮廣健，張佑紅，諶頡，黃萌，周鋒，胡凱

(武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

摘要：探討了恒定pH值對粘質沙雷氏菌ZSG7發(fā)酵產靈菌紅素的影響。結果表明，當發(fā)酵系統(tǒng)pH值恒定為7時，粘質沙雷氏菌生長速度最快，靈菌紅素產生速度最快且產量最高(0.3033 g·L-1)，比不調pH值的靈菌紅素最高產量0.2296 g·L-1高出32.1%。

關鍵詞：靈菌紅素；粘質沙雷氏菌；恒定pH值

靈菌紅素(prodigiosin，PG)是天然紅色素的統(tǒng)稱，通常含由3個吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結構[1]。它是由某些放線菌(如鏈霉菌屬)[2]、某些細菌(如粘質沙雷氏菌屬[3]、假單胞菌屬[4])等微生物產生的一種次級代謝產物。靈菌紅素具有多種重要特性，如抗菌、抗瘧疾、抗癌、免疫抑制、除藻等[5-10]，特別是對肺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種人癌細胞有一定的抑制作用，而且在相同的劑量下對正常細胞沒有明顯的毒害作用，因此靈菌紅素極有潛力被開發(fā)成為一種新型的抗癌藥物[11-13]。pH值是一個重要的環(huán)境因素，對發(fā)酵過程中細菌生長和產物生成有重要影響[14]。目前，采用恒定pH值研究粘質沙雷氏菌發(fā)酵產靈菌紅素的研究還未見報道，因此，作者采用自動發(fā)酵系統(tǒng)，研究恒定pH值對粘質沙雷氏菌產靈菌紅素的影響。

1實驗

1.1菌種

粘質沙雷氏菌ZSG，由本實驗室從糖化車間酸性土壤中篩選獲得并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCCNo:M209195)，菌株編號ZSG；粘質沙雷氏菌ZSG7，由粘質沙雷氏菌ZSG誘變所得。

1.2儀器

BIOSTAT?Aplus型生物反應器、BS124S型分析天平，Sartorius公司；AIRTECH型超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱、DZF-6050型真空干燥箱、YXQ-LS-75S型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TG18M型高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計，蘇州島津儀器有限公司；MFS-Ⅱ型多功能三維旋混儀，深圳潘西諾生物科技有限公司；200μL、1 000μL和5 000μL移液槍吸嘴、50mL離心管，Corning公司；移液槍，Nichiryo公司；封口膜，Parafilm公司；5mL流式管，武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂粉2%，NaCl0.5%。

種子培養(yǎng)基：蔗糖0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl0.5%，MgCl20.25%，吐溫80 1.0%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl0.5%，MgCl20.25%，吐溫80 1.0%，用0.1mol·L-1鹽酸溶液和1mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)發(fā)酵液pH值。

1.4方法

發(fā)酵方法：保藏菌種活化后接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于29 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)24 h后，按10%的接種量接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件：5 L發(fā)酵罐中裝液量為3 L，培養(yǎng)溫度29 ℃，發(fā)酵周期66 h，前12 h通氣量1.0 vvm且攪拌轉速控制在200 r·min-1；第12～24 h，將溶氧保持在30%；第24～66 h，將溶氧保持在60%。溶氧值用溶氧探頭實時監(jiān)控，并進行溶氧偶聯(lián)轉速自動調節(jié)。

實驗設置4個變量：不調控pH值、恒定pH值為5、恒定pH值為6、恒定pH值為7。通過發(fā)酵系統(tǒng)主機的蠕動泵用0.1 mol·L-1鹽酸溶液和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)發(fā)酵液pH值。

1.5菌體干重的測定

菌體干重標準曲線的繪制：取20 mL發(fā)酵液置于已知質量的50 mL離心管中，10 000 r·min-1離心20 min，蒸餾水洗滌后再離心，重復2次，余下的濕菌體置于80 ℃烘箱中烘干至恒量，稱量菌體干重(DCW,g·L-1)。再取1 mL發(fā)酵液，同樣用蒸餾水洗滌菌體2次，然后用生理鹽水將剩余濕菌體溶解稀釋至10 mL，測定600 nm處吸光度(OD600)。以DCW為橫坐標、OD600為縱坐標繪制菌體干重標準曲線。

通過測定發(fā)酵液在600 nm處吸光度即可依標準曲線擬合線性方程計算1 L發(fā)酵液中菌體干重。

1.6靈菌紅素含量的測定

靈菌紅素標準曲線的繪制：準確稱取提純的靈菌紅素粉末100 mg，用酸性甲醇溶液(pH=3.0)溶解并定容至1 000 mL，作為0.1 mg·mL-1的色素母液。分別準確吸取色素母液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，用酸性甲醇溶液定容至10 mL，測定534 nm處吸光度(OD534)。以靈菌紅素濃度為橫坐標、OD534為縱坐標繪制靈菌紅素標準曲線。

取發(fā)酵液1 mL，加入9 mL酸性甲醇溶液，劇烈振蕩5 min，破碎菌體，10 000 r·min-1離心10 min后取上清液，測定534 nm處吸光度，依標準曲線擬合線性方程計算發(fā)酵液中靈菌紅素含量。

2結果與討論

2.1菌體干重標準曲線(圖1)

圖1　菌體干重標準曲線

由圖1可看出，菌體干重與吸光度OD600線性關系良好，回歸得線性方程：y=1.3950x+0.0012，R2=0.9997。

2.2靈菌紅素標準曲線(圖2)

圖2　靈菌紅素標準曲線

由圖2可看出，靈菌紅素濃度與吸光度OD534線性關系良好，回歸得線性方程：y=0.0106x+0.0050，R2=0.9998。

2.3不同恒定pH值下菌體干重的變化

不調pH值時，隨著細菌的大量繁殖，發(fā)酵液pH值發(fā)生變化，如圖3所示。

由圖3可知，不調pH值時，發(fā)酵起始時pH值為5.4；之后經(jīng)過很短的時間，pH值達到最低點5.2；隨后發(fā)酵液pH值不斷上升，發(fā)酵10 h時，pH值接近6.0，發(fā)酵22 h時，pH值達到7.0；隨后發(fā)酵液pH值緩慢上升，在發(fā)酵50 h時pH值達到最高點7.8，隨后一直穩(wěn)定在7.8左右，直到發(fā)酵結束。

圖3　不調pH值時發(fā)酵液pH值變化曲線

調節(jié)pH值為恒定值，不同恒定pH值下菌體干重的變化如圖4所示。

圖4　不同恒定pH值下的菌體干重變化曲線

由圖4可知，當菌體大量繁殖時，恒定pH值為7時的菌體生長速度最快，其次是恒定pH值為6，最后是恒定pH值為5；恒定pH值為5的粘質沙雷氏菌生長速度在前10 h比不調pH值的要快，但10 h后不調pH值時的生長速度明顯比恒定pH值為5的要快，這是因為，發(fā)酵10 h后不調pH值的發(fā)酵液pH值接近6，并且隨著發(fā)酵的進行pH值從6升高到7，粘質沙雷氏菌的生長速度相應加快；恒定pH值為5時的最大菌體干重0.9684 g·L-1與不調pH值時的0.9288 g·L-1比較接近，但明顯低于恒定pH值為6時的1.0826 g·L-1與恒定pH值為7時的1.0998 g·L-1；恒定pH值為6與恒定pH值為7時的粘質沙雷氏菌的生長曲線接近，菌體干重最大值也比較接近，但恒定pH值為7時的菌體干重多高于恒定pH值為6時的菌體干重，且與恒定pH值為5的相差較大，表明粘質沙雷氏菌大量繁殖的最適恒定pH值為7。

2.4不同恒定pH值下靈菌紅素產量的變化曲線(圖5)

圖5　不同恒定pH值下靈菌紅素產量的變化曲線

由圖5可知，第10～30 h，粘質沙雷氏菌快速生長，靈菌紅素產量迅速升高，生長速度快慢依次為pH7>pH6>pH5，靈菌紅素產量高低依次為pH7 >pH6>pH5,表明在恒定pH值為5時，粘質沙雷氏菌產靈菌紅素受到影響，產量大大降低；恒定pH值為6時的靈菌紅素最高產量為0.2461 g·L-1，僅比不調pH值時的0.2296 g·L-1高出7.2%，二者相差不大；而不調pH值時的靈菌紅素產量在第12～24 h要高于恒定pH值為6，這是因為，不調pH值時的發(fā)酵液pH值在第12～24 h間從6上升到7，導致粘質沙雷氏菌的活性更高，產靈菌紅素的速度加快；當恒定pH值為7時，靈菌紅素產生速度最快，產量最高，達到0.3033 g·L-1，比不調pH值時高出32.1%。因此，粘質沙雷氏菌產靈菌紅素的最適恒定pH值為7。

3結論

研究了恒定pH值對粘質沙雷氏菌ZSG7產靈菌紅素的影響。當菌體大量繁殖時，恒定pH值下的菌體生長速度快慢依次為pH7>pH6>pH5。比較粘質沙雷氏菌最大菌體干重，發(fā)現(xiàn)恒定pH值為6與恒定pH值為7的比較接近，而且明顯高于恒定pH值為5和不調pH值。比較靈菌紅素產量，發(fā)現(xiàn)恒定pH值為5時的靈菌紅素產量很低，恒定pH值為6時的靈菌紅素產量大幅提高，與不調pH值時的產量接近，恒定pH值為7時的靈菌紅素產量最高，達到0.3033 g·L-1，比不調pH值時的最高產量0.2296 g·L-1高出32.1%。

參考文獻：

[1]MONTANER B,PEREZ-TOMAS R.The prodigiosins:A new family of anticancer drugs[J].Current Cancer Drug Targets,2003,3(1)：57-65.

[2]EL-BONDKLY A M,EL-GENDY M M,BASSYOUNI R H.Overproduction and biological activity of prodigiosin-like pigments from recombinant fusant of endophytic marineStreptomycesspecies[J].Antonie van Leeuwenhoek,2012,102(4)：719-734.

[3]GUTIERREZ-ROMAN M I,HOLGUIN-MELENDEZ F,BELLO-MENDOZA R,et al.Production of prodigiosin and chitinases by tropicalSerratiamarcescensstrains with potential to control plant pathogens [J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(1)：145-153.

[4]SAKATA T,YOSHIKAWA T,NISHITARUMIZU S.Algicidal activity and identification of an algicidal substance produced by marinePseudomonassp.C55a-2[J].Fisheries Science,2011,77(3)：397-402.

[5]LIU T J,YANG H L,TANG H.Progress on prodigiosin[J].Food and Drug,2007,8：15.

[6]SURYAWANSHI R K,PATIL C D,BORASE H P,et al.Studies on production and biological potential of prodigiosin bySerratiamarcescens[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,173(5)：1209-1221.

[7]MANSSON M,GRAM L,LARSEN T O.Production of bioactive secondary metabolites by marineVibrionaceae[J].Marine Drugs,2011,9(9)：1440-1468.

[8]PAPIREDDY K,SMILKSTEIN M,KELLY J X,et al.Antimalarial activity of natural and synthetic prodiginines[J].Journal of Medicinal Chemistry,2011,54(15)：5296-5306.

[9]HE J,HE X,ZHANG H Y,et al.Effect of the Chinese herbMesimareishiUE-1 on invasion of human ovarian cancer cellsinvitro[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(48)：9888-9897.

[10]JEONG H,YIM J H,LEE C,et al.Genomic blueprint ofHahellachejuensis,a marine microbe producing an algicidal agent[J].Nucleic Acids Research,2005,33(22)：7066-7073.

[11]KAVITHA R,AISWARIYA S,RATNAVALI C M.Anticancer activity of red pigment fromSerratiamarcescensin human cervix carcinoma[J].International Journal of Pharmaceutical Research,2010,2(1)：784-787.

[12]PANDEY R,CHANDER R,SAINIS K B.Prodigiosins as anti-cancer agents：Living upto their name[J].Current Pharmaceutical Design,2009,15(7)：732-741.

[13]SOTO-CERRATO V,VINALS F,LAMBERT J R,et al.Prodigiosin induces the proapoptotic gene NAG-1viaglycogen synthase kinase-3βactivity in human breast cancer cells[J].Molecular Cancer Therapeutics,2007,6(1)：362-369.

[14]HORIUCHI J I,SHIMIZU T,TADA K,et al.Selective production of organic acids in anaerobic acid reactor by pH control[J].Bioresource Technology,2002,82(3)：209-213.

Effect of Constant pH Value on Prodigiosin Producing bySerratiaMarcescens

RONG Guang-jian,ZHANG You-hong,CHEN Jie,HUANG Meng,ZHOU Feng,HU Kai

(KeyLaboratoryforGreenChemicalProcessofMinistryofEducation,SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy,WuhanInstituteofTechnology,Wuhan430074,China)

Abstract：The effect of constant pH value on prodigiosin producing by Serratia marcescens ZSG7 was discussed.The results showed that,when the pH value was kept 7,ZSG7 grew the fastest,generation speed of prodigiosin was the fastest,and the maximum production reached 0.3033 g·L-1,which was 32.1% higher than the maximum 0.2296 g·L-1under the unregulated pH value.

Keywords：prodigiosin;Serratia marcescens;constant pH value

中圖分類號：TQ 920

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)02-0046-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.010

作者簡介：榮廣健(1989-)，男，河北廊坊人，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程、生物制藥，E-mail:351966145@qq.com；通訊作者：張佑紅，教授，博士生導師。

收稿日期：2015-11-20