潘亞磊，郭玲麗，謝　培，宋忠興，唐志書，王　梅

(1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西

咸陽 712083；2.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

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杜仲松脂醇二葡萄糖苷的提取工藝優(yōu)化

潘亞磊1，郭玲麗2，謝培1，宋忠興1，唐志書1，王梅3

(1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西

咸陽 712083；2.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

摘要：首先采用二水平實驗篩選出提取杜仲松脂醇二葡萄糖苷的主要影響因素：乙醇體積分數(shù)、浸泡時間和提取次數(shù)；再以提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量為指標，通過正交實驗優(yōu)化提取工藝。確定最優(yōu)提取工藝為：將粉碎的杜仲皮以料液比1∶12(g∶mL)加入75%乙醇后浸泡24 h，超聲提取2次，每次20 min。在此條件下，提取物中松脂醇二葡萄糖苷的平均含量為1.51%。該優(yōu)化提取工藝簡單、快速、高效。

關鍵詞：杜仲；松脂醇二葡萄糖苷；提取工藝；二水平實驗；正交實驗

杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)是我國特有的藥用植物，為國家二級保護植物。杜仲皮是人們熟知的傳統(tǒng)名貴中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，謂其“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨，除陰下癢濕，小便余瀝。久服，輕身耐老”。近代藥理學研究表明,杜仲中的木脂素類成分不僅可通過抑制血管重構治療高血壓[1-2]，而且可以防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[3]。松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinoldiglucoside，PDG)是杜仲中含量最豐富的木脂素類化合物之一，其結構見圖1。PDG是杜仲降血壓和治療骨質(zhì)疏松的主要活性成分[4-5]，也是2015年版《中華人民共和國藥典》控制杜仲質(zhì)量的參照化合物[6]。目前對杜仲總木脂素的研究較多，且主要采用紫外分光光度法測定木脂素含量[7-9]。

作者在此首先采用二水平實驗篩選出提取杜仲PDG的主要影響因素：乙醇體積分數(shù)、浸泡時間和提取次數(shù)；再以提取物中PDG含量為指標，采用HPLC法精確測定PDG含量，通過正交實驗優(yōu)化提取工藝，擬為從杜仲中高效提取PDG奠定基礎。

圖1　松脂醇二葡萄糖苷的結構式

1實驗

1.1材料、試劑與儀器

杜仲藥材，陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司。

PDG對照品(批號 lot20140618，含量≥98%)，寶雞晨光生物科技有限公司；高效液相色譜用超純水；甲醇，色譜純，Adamas-beta公司；其余試劑均為分析純。

e2695型高效液相色譜儀，Waters；SY-2000型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；FW-1000AD型快速開蓋高速萬能粉碎機，天津鑫博得儀器有限公司；FA2704b型分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Vaco5型冷凍干燥機，ZRBUS；電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2PDG提取工藝流程

杜仲皮100 g→粉碎→過篩→加入溶劑→浸泡→超聲/回流提取→抽濾→濾液減壓濃縮→轉移至平皿-80 ℃預凍→低溫冷凍干燥→得到粉末狀固體。

1.3PDG提取工藝優(yōu)化

1.3.1二水平實驗

Plackett-Burman設計是一種二水平實驗方法，可用最少的實驗次數(shù)使因素盡可能精確地估計，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因素供進一步研究[10]。

本實驗采用Plackett-Burman設計對影響杜仲PDG提取效果的11個因素進行考察，以篩選主要影響因素。

1.3.2正交實驗

根據(jù)二水平實驗結果，選取乙醇體積分數(shù)、提取次數(shù)、浸泡時間作為主要因素，進行三因素三水平正交實驗，進一步優(yōu)化杜仲PDG提取工藝。

1.4PDG含量測定

采用HPLC法精確測定PDG濃度，按下式計算PDG含量(Y)：

式中：x為供試品中PDG濃度，mg·mL-1；V為供試品體積，mL；m為干燥杜仲皮粉末質(zhì)量，mg。

2結果與討論

2.1色譜方法學考察

2.1.1色譜條件

Waters e2695-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：277 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇-水(25∶75，體積比)；進樣量：10 μL?？瞻?、標準品及供試品的高效液相色譜見圖2。

2.1.2對照品溶液的配制

精密稱取PDG對照品0.7 mg，加入50%甲醇溶解，定容于5 mL量瓶中。

2.1.3標準曲線的繪制

取對照品溶液配制成系列濃度(mg·mL-1)：0.00175、0.00350、0.00700、0.01400、0.02800、0.05600、0.14000，通過高效液相色譜分離測定。以峰面積(y)為縱坐標、PDG濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得線性方程為：y=4×106x-6442.6，R=0.9976。表明，PDG濃度在0.00175～0.14000 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.4精密度實驗

精密吸取PDG對照品溶液0.1 mL，稀釋至標準曲線線性范圍內(nèi)，按色譜條件測定峰面積。重復測定5次，RSD為0.33%，表明該方法精密度較高。

2.1.5穩(wěn)定性實驗

精密吸取PDG對照品溶液0.1 mL，并稀釋至標準曲線線性范圍內(nèi)，按色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h測定峰面積。RSD為2.03%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

圖2空白(a)、PDG標準品(b)、供試品(c)的高效液相色譜

Fig.2HPLC of blank(a)，PDG standard(b)，sample(c)

2.1.6回收率實驗

精密稱取6種不同條件下所提取的PDG粉末適量，用甲醇溶解，過濾，取1.5 mL于樣品瓶中，再精密加入0.1 mL PDG對照品溶液，通過高效液相色譜測定，計算平均回收率為99.0%，RSD為1.31%。

2.2提取工藝優(yōu)化

2.2.1二水平實驗

選擇7個實際因素[料液比(A)、提取方式(B)、乙醇體積分數(shù)(C)、提取時間(D)、粉碎程度(E)、提取次數(shù)(F)、浸泡時間(G)]及4個虛擬因素(H、I、J、K)進行實驗次數(shù)為12的Plackett-Burman設計，7個實際因素與水平見表1，結果見表2。

表1Plackett-Burman設計因素與水平

Tab.1　Factors and levels of Plackett-Burman design

表2Plackett-Burman設計結果

Tab.2　Results of Plackett-Burman design

由表2可知，乙醇體積分數(shù)(C)、提取次數(shù)(F)、浸泡時間(G)對PDG含量的影響最大，影響率均大于20%，而料液比、提取方式、提取時間、粉碎程度對PDG含量的影響較小。因此，為方便實驗、節(jié)約能源，在藥材粉碎程度為10目、料液比為1∶12(g∶mL，下同)、提取時間為20 min、超聲提取方式下，對乙醇體積分數(shù)、提取次數(shù)、浸泡時間3個主要因素進行進一步的優(yōu)化實驗。

2.2.2正交實驗

文獻[11]報道，當只考察實驗因素自身的影響而不考察因素間的交互影響時，所選用的正交表列號應比因素數(shù)多一列或相等，故本實驗選用L9(34)正交表進行優(yōu)化實驗，正交實驗的因素與水平見表3，結果與分析見表4，方差分析見表5。

表3正交實驗因素與水平

Tab.3　Factors and levels of orthogonal experiment

表4正交實驗結果與分析

Tab.4　Results and analysis of orthogonal experiment

表5方差分析

Tab.5　Variance analysis

2.2.3驗證實驗

在最優(yōu)提取工藝條件下，重復3次實驗，以驗證該工藝的合理性和穩(wěn)定性。結果無顯著性差異，RSD值為1.32%，PDG的平均含量為1.51%。因此，確定3個主要影響因素為：乙醇體積分數(shù)75%、提取2次、浸泡時間24 h。

2.3討論

(1)影響杜仲PDG提取的因素較多，本實驗首先采用二水平實驗對影響因素進行了考察，在所選水平范圍內(nèi)，篩選出了3個主要因素；同時，二水平實驗結果發(fā)現(xiàn)，采用超聲和加熱回流對提取PDG結果影響相當，因此選用超聲法提取PDG，與呂強[12]的研究結論相同。

(2)杜仲中PDG不僅具有重要藥理學活性，而且其含量的高低還是判斷杜仲生藥及其產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標。杜仲中PDG含量和杜仲生長年限密切相關[13]，《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定PDG含量應大于0.10%[6]，可見PDG在杜仲中的總體含量較低，本實驗優(yōu)化建立的PDG提取工藝為充分利用杜仲資源奠定了基礎。

3結論

首先采用二水平實驗篩選出提取杜仲松脂醇二葡萄糖苷的主要影響因素：乙醇體積分數(shù)、浸泡時間和提取次數(shù)；再以提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量為指標，通過正交實驗優(yōu)化提取工藝。確定最優(yōu)提取工藝為：將粉碎的杜仲皮以料液比1∶12(g∶mL)加入75%乙醇中浸泡24 h，超聲提取2次，每次20 min。在此條件下，提取物中松脂醇二葡萄糖苷的平均含量為1.51%。該優(yōu)化提取工藝簡單、快速、高效。

參考文獻：

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Optimization on Extraction Process of Pinoresinol Diglucoside fromEucommiaUlmoidesOliv.

PAN Ya-lei1,GUO Ling-li2,XIE Pei1,SONG Zhong-xing1,TANG Zhi-shu1,WANG Mei3

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine,ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,ShaanxiProvinceKeyLaboratoryofNewDrugsandChineseMedicineFoundationResearch,Xianyang712083,China;2.CollegeofPharmacy,ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,China;3.TheAffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712000,China)

Abstract：A 2-level experiment was employed to screen the main factors(volume fraction of ethanol,soaking time,extraction times) for the pinoresinol diglucoside extract from Eucommia ulmoides Oliv..Using extraction content of pinoresinol diglucoside as an index,the optimal extraction conditions were optimized by orthogonal experiment.The optimal extraction process was as follows:the pulverized Eucommia ulmoides Oliv.cortex was soaked in 75% ethanol by solid-liquid ratio of 1∶12(g∶mL) for 24 h,then extracted 2 times by ultrasonic,and each time of 20 min.Under above conditions,the average content of pinoresinol diglucoside was 1.51%.The optimized extraction process was simple,fast and efficient.

Keywords：Eucommia ulmoides Oliv.;pinoresinol diglucoside;extraction process;2-level experiment;orthogonal experiment

中圖分類號：TQ 351

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)02-0042-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.009

作者簡介：潘亞磊(1984-)，男，河北邢臺人，博士，講師，主要從事中藥藥理及骨質(zhì)疏松的防治研究，E-mail：panyalei588@163.com。

收稿日期：2015-11-02

基金項目：陜西省科技廳項目(2015SF073)，陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2011KTCL03-05)，陜西省科技資源開放共享平臺項目(2015FWPT-01)