馬景景 劉曉璇 孫志婷 劉蘭霞 冷希崗

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所

·論著·

功能化修飾多壁碳納米管對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的毒性研究

馬景景 劉曉璇 孫志婷 劉蘭霞 冷希崗

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所

目的 探討不同功能化修飾的多壁碳納米管（F-MWCNTs）對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的細(xì)胞毒性的影響。 方法 利用透射電鏡表征5種直徑和長(zhǎng)度均相同的MWCNTs（羥基、羧基、氨基、鍍鎳修飾和未修飾的MWCNTs（P-MWCNTs））在生理鹽水溶液中的分散性。體外實(shí)驗(yàn)中先通過(guò)Ficoll密度梯度離心從人外周血中分離出PBMC，再將5種MWCNTs分別超聲分散于含血清的培養(yǎng)基中，與PBMC共培養(yǎng)12、24、48、72 h，通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)5種MWCNTs對(duì)PBMC的細(xì)胞毒性。結(jié)果 5種MWCNTs的分散性相對(duì)良好，尤其是各F-MWCNTs。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MWCNTs的細(xì)胞毒性呈劑量-效應(yīng)關(guān)系和一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。F-MWCNTs與P-MWCNTs相比，細(xì)胞毒性發(fā)生顯著變化，其中羥基、羧基和氨基修飾的MWCNTs的細(xì)胞毒性減小，尤以氨基修飾的細(xì)胞毒性減小最為顯著（P＜0.05）；而鍍鎳修飾的MWCNTs的細(xì)胞毒性反而明顯增大，其處理細(xì)胞24 h和48 h時(shí)的細(xì)胞存活率較同劑量（25 μg/ml）的P-MWCNTs均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。 結(jié)論 功能化修飾不僅影響MWCNTs在水溶液中的分散性，還影響MWCNTs對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

多壁碳納米管； 人外周血單個(gè)核細(xì)胞； 細(xì)胞毒性； 功能化修飾

0 引言

碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）因其獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的電熱理化性能，廣泛應(yīng)用于電子器件、復(fù)合材料及生物醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域[1-2]。CNTs根據(jù)其管壁層數(shù)，分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes,SWCNTs）和多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes,MWCNTs）；根據(jù)其表面是否被修飾，分為未修飾的碳納米管（pristine CNTs，P-CNTs）和功能化修飾的碳納米管（functionalized CNTs，F(xiàn)-CNTs）。P-CNTs呈疏水性，在生理溶液下容易聚集成束，進(jìn)入機(jī)體后易被吞噬細(xì)胞吞噬導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡，從而限制了其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。通過(guò)對(duì)CNTs表面進(jìn)行功能化修飾，不僅可改善其表面特性，提高其生物相容性，還可作為藥物遞送載體靶向輸運(yùn)藥物[3]。對(duì)CNTs的功能化修飾通常有以下幾種方式：通過(guò)側(cè)壁吸附生物活性分子；將生物分子共價(jià)連接于CNTs表面；將分子包裹于CNTs腔內(nèi)[4]。近年來(lái)，研究人員對(duì)納米材料作為藥物載體產(chǎn)生了濃厚興趣[5]。其中CNTs作為藥物載體用于各種癌癥的治療受到諸多學(xué)者的青睞，通過(guò)將紫杉醇、阿霉素等治療藥物結(jié)合于CNTs表面，憑借CNTs高負(fù)載率、靶向性和控制釋放的優(yōu)勢(shì)從而達(dá)到良好的抗癌效果[6-7]。

鑒于CNTs的廣泛應(yīng)用，關(guān)于其生物安全方面的研究顯得極其重要。近年來(lái)，關(guān)于CNTs的生物毒性評(píng)價(jià)的研究逐漸增多，如對(duì)血液循環(huán)、淋巴回流、肺部及心臟等的影響[8-9]。由于CNTs很輕，易分散于空氣中被人吸入，因此關(guān)于CNTs對(duì)人肺部毒性的研究是最早被關(guān)注的。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)：將一定量的CNTs灌注入小鼠體內(nèi)，會(huì)引起肺部炎癥、氧化損傷和纖維化[10]。近幾年關(guān)于CNTs的免疫毒性研究也逐漸增多，大多是研究CNTs對(duì)單個(gè)免疫細(xì)胞的影響，包括巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等[11]。由于免疫細(xì)胞之間是通過(guò)相互作用來(lái)發(fā)揮作用的，本研究以人外周血單個(gè)核細(xì)胞（human peripheral blood mononuclear cell,PBMC）為研究對(duì)象，研究了未修飾的MWCNTs（P-MWCNTs）和4種不同功能化修飾的MWCNTs（F-MWCNTs）對(duì)PBMC的毒性影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

5種MWCNTs（羥基、羧基、氨基、鍍鎳修飾的MWCNTs及P-MWCNTs）（北京德科島金科技有限公司），淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），微柵（北京新興百瑞技術(shù)有限公司），細(xì)胞增殖-毒性試劑盒（CCK-8 kit）（日本同仁化學(xué)研究所）。SpectraMaxPlus384酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），Tecnai GZ F20透射電鏡（荷蘭FEI公司），Sigma 2-16K離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 MWCNTs懸液的制備

分別稱(chēng)取5種MWCNTs各10 mg，置于20 ml的玻璃瓶中，加入10 ml含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，使MWCNTs的最終質(zhì)量濃度為1 mg/ml，室溫下以70%功率超聲30 min，然后12 000×g離心5 min，收集懸液備用。

1.2.2 透射電鏡觀(guān)察

將MWCNTs懸液稀釋至肉眼可見(jiàn)黑色，用移液槍吸取10 μl稀釋后的懸液，滴于微柵的支持膜面，再將微柵置于干凈濾紙上晾干，即可用透射電鏡觀(guān)察并測(cè)量MWCNTs的直徑。

1.2.3 PBMC的分離

在10 ml離心管中加入4 ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液充分混勻，用吸管沿管壁將其緩慢疊加于分層液面上，注意保持界面清晰；然后于室溫下450×g離心20 min，離心后管內(nèi)細(xì)胞分為3層，上層為血漿和Hank's液，中層為淋巴細(xì)胞分離液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，在上、中層界面處有一以PBMC為主的白色云霧層狹窄帶（圖1）。將移液器小心插入云霧層，吸取PBMC。置入10 ml玻璃離心管中，加入5倍體積的Hank's液，300×g離心10 min，按該法洗滌細(xì)胞兩次；末次離心后，棄上清，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞；取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2%臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，再按以下公式計(jì)算PBMC的濃度

PBMC濃度（細(xì)胞數(shù)/1 ml細(xì)胞懸液）＝4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)

1.2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞計(jì)數(shù)后向PBMC中加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；然后以2×106個(gè)細(xì)胞/孔鋪板，每孔200μl；隨后向?qū)嶒?yàn)組中分別加入MWCNTs懸液，使得MWCNTs的最終質(zhì)量濃度分別為25或50 μg/ml，陽(yáng)性對(duì)照組中加入終質(zhì)量濃度為50 μg/ml的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），陰性對(duì)照組則只有含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培

圖1 密度梯度離心分離PBMC

養(yǎng)基，置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48、72 h；再向每孔中加入20 μl CCK-8溶液，于37℃培養(yǎng)箱中避光孵育2 h；分別取各孔上清液100 μl，加至一新96孔板的相應(yīng)孔中，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（OD）值，再以≥600 nm的任一波長(zhǎng)為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，計(jì)算細(xì)胞存活率

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MWCNTs的表征

MWCNTs在水中的分散性可能會(huì)影響其毒性及免疫安全性評(píng)價(jià)結(jié)果。本研究采用透射電鏡對(duì)5種MWCNTs的形態(tài)及分散性進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖2所示，5種MWCNTs的分散性良好，其中F-MWCNTs的分散性?xún)?yōu)于P-MWCNTs。材料購(gòu)買(mǎi)時(shí)提供的和通過(guò)透射電鏡表征得到的部分參數(shù)見(jiàn)表1，其中直徑1和長(zhǎng)度是樣品說(shuō)明書(shū)標(biāo)注的，直徑2是將MWCNTs分散于水溶液中，經(jīng)透射電鏡測(cè)得。

2.2 不同表面修飾的MWCNTs對(duì)PBMC細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞毒結(jié)果如圖3顯示，在12、24、48和72 h的各時(shí)間點(diǎn)，5種MWCNTs處理PBMC的存活率均隨濃度升高而下降，其中50μg/ml氨基修飾的MWCNTs處理PBMC 12 h時(shí)的細(xì)胞存活率較25 μg/ml處理下的存活率低（P＜0.05）；類(lèi)似的，50 μg/ml羧基、氨基及鍍鎳修飾的MWCNTs處理PBMC 72 h時(shí)的細(xì)胞存活率也分別較25 μg/ml處理下的存活率低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在48 h內(nèi)MWCNTs處理PBMC的存活率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，其中與12 h時(shí)相比，25 μg/ml的羧基修飾的MWCNTs（P＜0.01）、鍍鎳修飾的MWCNTs（P＜0.05）和50 μg/ml的羥基修飾的MWCNTs（P＜0.05）處理PBMC 24 h時(shí)的細(xì)胞存活率均有所降低；與24 h時(shí)相比，除鍍鎳修飾外的其他4種MWCNTs分別以2種質(zhì)量濃度處理PBMC 48 h時(shí)的細(xì)胞存活率均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表現(xiàn)出一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。然而，低質(zhì)量濃度25 μg/ml的4種F-MWCNTs處理PBMC 72 h時(shí)的細(xì)胞存活率反而較48 h時(shí)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明PBMC對(duì)MWCNTs有一定的應(yīng)激反應(yīng)。

表1 5種多壁碳納米管的類(lèi)型及參數(shù)

與P-MWCNTs相比，F(xiàn)-MWCNTs的細(xì)胞毒性發(fā)生了變化，其中羥基、羧基和氨基修飾的MWCNTs的細(xì)胞毒性減小，尤以氨基修飾的細(xì)胞毒性減小最為顯著（P＜0.05）；而鍍鎳修飾的MWCNTs的細(xì)胞毒性則明顯增大，其處理PBMC 24 h和48 h的細(xì)胞存活率較同劑量（25μg/ml）的P-MWCNTs均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。各時(shí)間點(diǎn)相同質(zhì)量濃度的羥基、羧基和氨基修飾的MWCNTs細(xì)胞毒性間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 5種MWCNTs的透射電鏡圖

圖3 與MWCNTs共孵育不同時(shí)間后PBMC的細(xì)胞存活率

3 討論與結(jié)論

PBMC包括多種免疫細(xì)胞類(lèi)型，CNTs作為藥物載體常以靜脈注射的方式給藥[12]，因此，研究CNTs對(duì)PBMC的細(xì)胞毒性對(duì)評(píng)價(jià)其毒性具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，與P-MWCNTs相比，羥基、羧基和氨基化修飾不僅改善了MWCNTs在水溶液中的分散性，而且減弱了其對(duì)PBMC的細(xì)胞毒性，尤以氨基修飾的細(xì)胞毒性減弱最為顯著（P＜0.05）；而羥基、羧基和氨基修飾的MWCNTs之間的細(xì)胞毒性比較，差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此推斷P-MWCNTs的細(xì)胞毒性較大，可能主要是由于其在水溶液中易于聚集所致。有研究表明修飾可降低CNTs引起的細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡，也有研究表明功能化修飾可降低CNTs對(duì)DNA的損傷、減少NLRP3炎性體的活性，從而提高其生物相容性[13-14]。

鍍鎳修飾的MWCNTs廣泛應(yīng)用于葡萄糖傳感器的電極，因其具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已成為此專(zhuān)業(yè)的研究焦點(diǎn)[15]。細(xì)胞毒性研究結(jié)果表明，鍍鎳修飾的MWCNTs顯著增強(qiáng)了對(duì)PBMC的細(xì)胞毒性。已有研究表明，金屬鎳可通過(guò)引

起損傷DNA、抑制DNA損傷修復(fù)酶的活性、產(chǎn)生活性氧導(dǎo)致氧化損傷或阻斷細(xì)胞周期于G2/M期等引起細(xì)胞凋亡或壞死[16]。

[5]高永峰,曾小偉,馮思慎,等.星形聚合物作為納米藥物載體的研究進(jìn)展[J].國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2015,38(1):52-56.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.013. Gao YF,Zeng XW,Feng SS,et al.Star-shaped block polymers for nanomedicine development[J].Int J Biomed Eng,2015,38(1):52-56.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.013.

[6]Zhang LW,Rong PF,Chen ML,et al.A novel single walled carbon nanotube(SWCNT)functionalization agent facilitating in vivo combined chemo/thermo therapy[J].Nanoscale,2015,7(39):16204-16213.DOI:10.1039/c5nr03752b.

[7]Qi X,Rui Y,Fan Y,et al.Galactosylated chitosan-grafted multiwall carbon nanotubes for pH-dependent sustained release and hepatic tumor-targeted delivery of doxorubicin in vivo[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2015,133:314-322.DOI:10.1016/j.colsurfb.2015.06. 003.

[8]Kido T,Tsunoda M,Kasai T,et al.The increases in relative mRNA expressions of inflammatory cytokines and chemokines in splenic macrophages from rats exposed to multi-walled carbon nanotubes by whole-body inhalation for 13 weeks[J].Inhal Toxicol,2014,26(12): 750-758.DOI:10.3109/08958378.2014.953275.

[9]董霞,劉蘭霞,朱敦皖,等.低分子質(zhì)量殼聚糖修飾多壁碳納米管的制備及細(xì)胞毒性研究[J].國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2015,38 (1):11-14.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.003. Dong X,Liu LX,Zhu DW,et al.Preparation and cytotoxicity study of multi-wailed carbon nanotubes modified with low-molecularweight chitosan[J].Int J Biomed Eng,2015,38(1):11-14.DOI:10. 3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.003.

[10]Silva RM,Doudrick K,Franzi LM,et al.Instillation versus inhalation of multiwalled carbon nanotubes:exposure-related health effects,clearance,and the role of particle characteristics[J].ACS Nano,2014,8(9):8911-8931.DOI:10.1021/nn503887r.

[11]Orecchioni M,Bedognetti D,Sgarrella F,et al.Impact of carbon nanotubes and graphene on immune cells[J].J Transl Med,2014,12: 138.DOI:10.1186/1479-5876-12-138.

[12]Vlasova MA,Tarasova OS,Riikonen J,et al.Injected nanoparticles: the combination of experimental systems to assess cardiovascular adverse effects[J].Eur J Pharm Biopharm,2014,87(1):64-72.DOI: 10.1016/j.ejpb.2014.02.001.

[13]Liu Z,Dong X,Song L,et al.Carboxylation of multiwalled carbon nanotube enhanced its biocompatibility with L02 cells through decreased activation of mitochondrial apoptotic pathway[J].J Biomed Mater Res A,2014,102(3):665-673.DOI:10.1002/jbm.a.34729.

[14]濮吉,陳田,陳章健,等.比較不同長(zhǎng)度及表面修飾的多壁碳納米管的細(xì)胞毒性和遺傳毒性[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2013, 45(3):405-411.DOI:10.3969/j.issn.1671-167X.2013.03.013. Pu J,Chen T,Chen Z J,et al.Comparative analysis for the cytotoxicity and genotoxicity of multi-walled carbon nanotubes with different lengths and surface modifications in A549 cells[J].J Peking Univ Health Sci,2013,45(3):405-411.DOI:10.3969/j.issn.1671-167X.2013.03.013.

[15]Zhu ZG,Chen C,Zhu XR,et al.Effects of Ni deposition on the electrochemical properties of CNT/Ni electrode and its application for glucose sensing[J].J Nanosci Nanotechnol,2015,15(4):3196-3199.DOI:10.1166/jnn.2015.9664.

[16]Lee YJ,Lim SS,Baek BJ,et al.Nickel(II)-induced nasal epithelial toxicity and oxidative mitochondrial damage[J].Environ Toxicol Pharmacol,2016,42:76-84.DOI:10.1016/j.etap.2016.01.005.

[1]Hou WC,He CJ,Wang YS,et al.Phototransformation-induced aggregation of functionalized single-walled carbon nanotubes:the importance of amorphous carbon[J].Environ Sci Technol,2016,50 (7):3494-502.DOI:10.1021/acs.est.5b04727.

[2]Notarianni M,Liu JZ,Vernon K,et al.Synthesis and applications of carbon nanomaterials for energy generation and storage[J].Beilstein J Nanotechnol,2016,7:149-196.DOI:10.3762/bjnano.7.17.

[3]Hassan HA,Smyth L,Rubio N,et al.Carbon nanotubes'surface chemistry determines their potency as vaccine nanocarriers in vitro and in vivo[J].J Control Release,2016,225:205-216.DOI:10.1016/ j.jconrel.2016.01.030.

[4]Sinnott SB.Chemical functionalization of carbon nanotubes[J].J Nanosci Nanotechnol,2002,2(2):113-123.DOI:10.1166/jnn.2002. 107.

Effects of functionalization of multi-walled carbon nanotubes on human peripheral blood mononuclear cell

Ma Jingjing,Liu Xiaoxuan,Sun Zhiting,Liu Lanxia,Leng Xigang
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China Corresponding author:Liu Lanxia,Email:liulanxiabme@163.com

Objective To explore the effects of surface functionalized multi-walled carbon nanotubes(FMWCNTs)on the cytotoxicity of human peripheral blood mononuclear cell(PBMC).Methods Five different types of MWCNTs(hydroxylated,carboxylated,aminated,nickel-plated and pristine MWCNTs(P-MWCNTs))with the same diameter and length were evaluated the dispersion and characterizations in physiological salt solution by transmission electron microscopy.PBMC were isolated by density gradient centrifugation from human peripheral blood,and 5 types of MWCNTs were ultrasonically dispersed in serum-containing medium respectively.After incubation with PBMC for 12,24,48 or 72 h,cytotoxicity was detected by CCK-8 kits.Results All the MWCNTs had well dispersion, especially the F-MWCNTs.Cytotoxicity results showed that all types of MWCNTs could induced PBMC death,and presented dose-dependence manner and a certain degree of time-dependence manner.Compared with the PMWCNTs,F-MWCNTs changed cytotoxicity statistically,with the hydroxylated,carboxylated,aminated MWCNTs weakened,aminated MWCNTs significant(P＜0.05),nevertheless the nickel-plated MWCNTs increased.Compared with the P-MWCNTs(25 μg/ml),cell viability of PBMC after 24 and 48 h incubation with the same dose of nickelplated MWCNTs both decreased,and the differences was statistically significant(P＜0.01,P＜0.05).Conclusions The functional group modification affects not only the MWCNTs dispersion in medium,but also the cytotoxicity of the MWCNTs on PBMC.

Multi-walled carbon nanotubes; Human peripheral blood mononuclear cell; Cytotoxicity; Functionalization

National Natural Science Foundation of Youth Foundation of China(31200674);Tianjin Science and Technology Program Jointly Funded Project Surface(15JCYBJC47600)

劉蘭霞，liulanxiabme@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．02．003

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31200674）；天津市科技計(jì)劃聯(lián)合資助面上項(xiàng)目（15JCYBJC47600）

2015-12-20）

綜上所述，功能化修飾MWCNTs不僅影響其表面特性，也影響其對(duì)PBMC的細(xì)胞毒性。因此在對(duì)CNTs進(jìn)行功能化修飾時(shí)，除了注重其應(yīng)用方面的研究，還要考察其相關(guān)的毒性問(wèn)題。

利益沖突 無(wú)