趙舒怡 儲小飛 劉偉利 孟慶慧 崔明 樊賽軍

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室（趙舒怡、儲小飛、劉偉利、崔明、樊賽軍）；20097 Washington DC，Department of Oncology，Lombardi Comprehensive Cancer Center，Georgetown University（孟慶慧）

唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白對肺癌細(xì)胞放射敏感性影響的研究

趙舒怡 儲小飛 劉偉利 孟慶慧 崔明 樊賽軍

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室（趙舒怡、儲小飛、劉偉利、崔明、樊賽軍）；20097 Washington DC，Department of Oncology，Lombardi Comprehensive Cancer Center，Georgetown University（孟慶慧）

目的對唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白（CLPTM1L）的表達(dá)與肺癌細(xì)胞放射敏感性改變的相關(guān)性進(jìn)行研究。方法采用噻唑藍(lán)（MTT）方法和細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞的生長和生存率；采用蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）方法檢測蛋白表達(dá)水平。結(jié)果不同肺癌細(xì)胞的放射敏感性與其細(xì)胞中CLPTM1L的蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，CLPTM1L高表達(dá)的肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出低放射敏感性；提高肺癌細(xì)胞中CLPTM1L的表達(dá)水平可明顯降低γ射線輻照后細(xì)胞的放射敏感性，相反轉(zhuǎn)染CLPTM1L小干擾RNA（siRNA）降低CLPTM1L表達(dá)水平則大大提高了肺癌細(xì)胞的放射治療敏感性。結(jié)論CLPTM1L可能是調(diào)節(jié)肺癌放射治療敏感性的一種新靶向基因。

唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白；輻射耐受性；肺腫瘤；γ射線

Fund program:Research Institute of Technology Development and Research Projects of Special Funds from Ministry of Science and Technology(2014EG150134);National Natural Science Foundation of China(81172127, 81572969);Key Technology Research and Development Program of Tianjin(14ZCZDSY00001);Development Fund of Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences(1559,1549)

0 引言

肺癌已經(jīng)成為我國大中城市中死亡率增長最快的癌癥，也是我國首位惡性腫瘤死亡原因，而且發(fā)病年齡也呈逐漸年輕化的趨勢[1]。根據(jù)病理類型，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。肺癌中有80%為非小細(xì)胞肺癌，其包括鱗癌、腺癌及大細(xì)胞癌等。手術(shù)、放射治療（簡稱放療）、化學(xué)藥物治療（簡稱化療）、分子靶向治療和細(xì)胞免疫治療是目前肺癌的主要治療方法。放療是使用高能量電離輻射所產(chǎn)生的射線對腫瘤局部進(jìn)行照射，通過能量的釋放阻止癌細(xì)胞生長和破壞癌細(xì)胞的正常功能，以達(dá)到使腫瘤生長阻滯、減小甚至消失的目的。在手術(shù)前使用放療，能縮小癌腫瘤體積，方便手術(shù)切除，也可使不適合手術(shù)的患者重新贏得手術(shù)機(jī)會；在手術(shù)后給予放療則可降低局部和區(qū)域淋巴結(jié)的復(fù)發(fā)率，以提高治愈率和生存率。而對于一些晚期無法手術(shù)的患者來說，放療能緩解疼痛、減輕壓迫癥狀、延長生命和提高生存質(zhì)量[2]。立體定向消融的放療可應(yīng)用于治療早期不能或不愿意手術(shù)的肺癌患者，臨床試驗表明，立體定向消融放療治療早期肺癌患者的1年生存率為94.7%，3年生存率為84.7%，5年生存率為62%~72%[3]。因此，放療是肺癌治療中不可缺少的治療手段。

然而，在放療過程中，肺癌患者往往逐漸對放療產(chǎn)生耐輻射性，對治療越來越不敏感，因此需加大照射劑量，然而大劑量會給患者帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)和并發(fā)癥，從而大大降低了患者的生存質(zhì)量。因此，尋找造成肺癌耐輻射產(chǎn)生的機(jī)制，改變放射敏感性，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平和功能，增加肺癌對放療的敏感性，降低和減少治療中對正常肺和其他組織造成的放射損傷，從而提升患者放療的療效，是目前肺癌放療在臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。本研究旨在研究唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白（cleft lip and palate transmembrane 1 like，CLPTM1L）的表達(dá)與肺癌細(xì)胞放射敏感性改變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

H2170、H23、SK-MES-1、NCI-H460、H441、HTB-58、A549共7種不同的人類肺癌細(xì)胞系和鼠肺癌Lewis細(xì)胞（美國Georgetown大學(xué)細(xì)胞服務(wù)中心），血清、青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），DH5α感受態(tài)菌（天根生化科技（北京）有限公司），質(zhì)粒抽提純化試劑盒（日本Takara公司），Lipofectamine 2000（美國Invetrogene公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），I抗（ab98239）（美國艾博抗公司），Ⅱ抗（sc-2030）（美國Santa Cruz公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（美國Sigma公司），高炅敏度電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence, ELC）試劑盒（中國康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

Thermo311 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），USD Autocell40137Cs輻照儀（加拿大原子能有限公司），Infinite?200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和照射條件

H2170、H23、SK-MES-1、NCI-H460、H441、HTB-58及A549共7種不同的人類肺癌細(xì)胞系和鼠肺癌Lewis細(xì)胞系均單層貼壁生長，并培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%血清、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。照射實驗1組為上述7種不同的人類肺癌細(xì)胞系；照射實驗2組分別為H2170細(xì)胞轉(zhuǎn)染CLPTM1L小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）或Control siRNA表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染pcDNA3 CLPTM1L的A549細(xì)胞和pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞；照射實驗3組分別為空白對照細(xì)胞、轉(zhuǎn)染CLPTM1L siRNA的Lewis細(xì)胞、轉(zhuǎn)染Control siRNA的Lewis細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3 CLPTM1L的Lewis細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3的Lewis細(xì)胞。所有實驗組均采用137Cs輻照儀產(chǎn)生的γ射線（250cGy/min）照射細(xì)胞。1.2.2質(zhì)粒擴(kuò)增

DH5α感受態(tài)菌經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，用小量提取柱離心式質(zhì)粒抽提純化試劑盒提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切、瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3 噻唑藍(lán)方法

照射后的細(xì)胞以3×104個/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)20 h后，每孔加20 μl噻唑藍(lán)（MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)基，加120 μl DMSO并振搖10 min。然后用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在波長570 nm處的吸光度（OD）值（參考波長為450 nm），以未加轉(zhuǎn)染和未照射的細(xì)胞為對照組，其細(xì)胞存活率為100%，實驗組的細(xì)胞存活率計算公式如下

1.2.4 克隆形成實驗

實驗2組的肺癌細(xì)胞分別接受0、2、4、6、8、10 Gy輻射照射后，按不同的照射劑量分別對應(yīng)接種500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000的不同數(shù)量細(xì)胞到60 mm培養(yǎng)皿。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3周后用甲醇固定，加姬姆薩應(yīng)用液染色30 min，流水洗凈，計數(shù)細(xì)胞數(shù)≥50的克隆個數(shù)。

1.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h將肺癌細(xì)胞種植于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至60%～70%時，將2 μg表達(dá)質(zhì)粒和2 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法

收集實驗1組和實驗2組的細(xì)胞，離心，懸浮于裂解液中，并置冰上裂解細(xì)胞2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白至相同濃度。樣品加入等體積2×SDS加樣緩沖液，沸水煮沸5 min，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜；封閉液封閉2 h。加I抗，4℃孵育過夜；TBST洗3次，每次15 min；加相應(yīng)的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min；用ECL法檢測蛋白表達(dá)。免疫印跡所用試劑（細(xì)胞裂解液、SDS加樣緩沖液、封閉液、TBST）用法見文獻(xiàn)[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗至少重復(fù)3次。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對照組和各處理實驗組結(jié)果均取自不同實驗樣本的均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組之間數(shù)據(jù)的比較采用雙側(cè)t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細(xì)胞放射敏感性與唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)

采用5 Gy單劑量γ射線照射實驗1組的7種人類肺癌細(xì)胞，照射后24 h采用MTT細(xì)胞增殖分析方法檢測這些肺癌細(xì)胞的增殖情況。7種細(xì)胞放射敏感性從高到低的排列順序分別為A549＞HTB-58＞H23＞H441＞SK-MES-1＞NCI-H460＞H2170（圖1）。檢測這些肺癌細(xì)胞中CLPTM1L表達(dá)水平的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLPTM1L的表達(dá)水平在H2170細(xì)胞最高，其次為NCI-H460和SK-MES-1細(xì)胞，其他HTB-58、H23、H441和A549 4種細(xì)胞則非常低（圖1）。實驗結(jié)果表明，肺癌細(xì)胞的放射敏感性正好與其所含的CLPTM1L表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；反之，高水平表達(dá)CLPTM1L的肺癌細(xì)胞，其受到輻射照射抑制細(xì)胞增殖的影響相對于低水平的CLPTM1L表達(dá)肺癌細(xì)胞要小。

圖1CLPTM1L表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)性

2.2 改變唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白表達(dá)水平可調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的放射敏感性

如圖2所示，轉(zhuǎn)染CLPTM1L siRNA到含有高CLPTM1L蛋白水平的H2170細(xì)胞中，明顯降低了細(xì)胞中CLPTM1L蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果表明，與Control siRNA轉(zhuǎn)染后的H2170細(xì)胞（90%抑制率（IC90）對應(yīng)6.8Gy）相比，H2170/CLPTM1L siRNA細(xì)胞（IC90對應(yīng)2.1 Gy）放射敏感性明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.982，P=0.007 5）；而通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法將pcDNA3 CLPTM1L表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到含有低CLPTM1L表達(dá)水平的A549細(xì)胞，明顯提高了細(xì)胞中CLPTM1L蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染對照pcDNA3“空”質(zhì)粒后的A549/對新霉素抗藥（Neo）細(xì)胞（IC90對應(yīng)3.6 Gy）相比，轉(zhuǎn)染有pcDNA3 CLPTM1L表達(dá)質(zhì)粒的A549/ CLPTM1L細(xì)胞（IC90對應(yīng)8.4 Gy）放射敏感性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.235，P=0.002 7）。因此，改變這兩種肺癌細(xì)胞中的CLPTM1L表達(dá)水平，無論是升高還是降低CLPTM1L表達(dá)水平，確實可調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的放射敏感性，且兩者呈負(fù)相關(guān)性。

相同實驗方法的鼠肺癌Lewis細(xì)胞的實驗結(jié)果表明，CLPTM1L同樣也可調(diào)節(jié)Lewis鼠肺癌細(xì)胞的放射敏感性，增加CLPTM1L表達(dá)明顯降低了細(xì)胞的放射敏感性；相反，降低其表達(dá)水平則提高了細(xì)胞的放射敏感性（圖3）。這些研究結(jié)果非常清楚地表明，無論是在人肺癌細(xì)胞還是在鼠肺癌細(xì)胞中，人為地改變肺癌細(xì)胞中CLPTM1L的表達(dá)水平均可明顯地影響肺癌細(xì)胞的放射敏感性。

圖2 改變CLPTM1L的表達(dá)水平對人類肺癌細(xì)胞放射敏感性的影響

圖3 改變CLPTM1L的表達(dá)水平對鼠肺癌細(xì)胞放射敏感性的影響

3 討論與結(jié)論

肺癌屬于多基因疾病，即多個基因的變異共同參與發(fā)病。研究表明攜帶基因變異的個體比非攜帶者具有更高的患病風(fēng)險，故將這些基因稱為“易感基因”。2011年來自南京醫(yī)科大學(xué)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院等研究機(jī)構(gòu)的科研人員通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）對5 408名受試者（其中包括2 331例肺癌患者以及3 077名未患該病的對照個體）進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步對另一組12 722名受試者（其中包括6 313例肺癌患者以及6 409名對照個體）進(jìn)行了檢測，他們鑒定出了4個與漢族肺癌人群相關(guān)聯(lián)的易感風(fēng)險位點(diǎn)，即3q28、5p15.33、13q12.12和22q12.2[5]。其他研究也發(fā)現(xiàn)染色體5p15.33區(qū)域與肺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。染色體5p15.33區(qū)域存在兩個已知的基因，分別是基因端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和CLPTM1L，這兩個基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的發(fā)展相關(guān)[8]。

CLPTM1L蛋白也稱之為順氯氨鉑耐藥相關(guān)蛋白（CRR9p或CRR9蛋白）[9-10]。該基因定位于染色體5p15.33，含有538個氨基酸，產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為62 ku；且人和鼠的蛋白均含有538個氨基酸，蛋白序列吻合度超過99%。目前全基因組關(guān)聯(lián)研究揭示CLPTM1L基因單核苷酸多態(tài)性（如rs401681和rs402710）與肺癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胃腸道間質(zhì)瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、子宮頸癌和家族性睪丸生殖細(xì)胞腫瘤等在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系，而且常常與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的單核苷酸多態(tài)性改變同時發(fā)生[11-12]；此外在臨床肺癌患者組織細(xì)胞中，特別是在腺癌組織細(xì)胞中，CLPTM1L1表達(dá)水平比正常肺組織中的表達(dá)水平明顯偏高[9]，但有關(guān)CLPTM1L在腫瘤中所起到的生物學(xué)功能和作用則鮮有報道。

本研究的實驗結(jié)果證實：①不同肺癌細(xì)胞的放射敏感性與其細(xì)胞中CLPTM1L蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，CLPTM1L高表達(dá)的肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出低放射敏感性。②人為增加肺癌細(xì)胞中CLPTM1L的表達(dá)水平可明顯降低其對γ射線輻照的放射敏感性，相反降低CLPTM1L表達(dá)水平則可大大提高肺癌細(xì)胞的放射治療敏感性。這些實驗結(jié)果為CLPTM1L與肺癌細(xì)胞的放射治療敏感性存在密切關(guān)系提供了直接的證據(jù)。文獻(xiàn)[13]也揭示CLPTM1L可降低腫瘤細(xì)胞對順氯氨鉑治療的敏感性。

因此，采用體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞模型和肺癌體內(nèi)動物模型深入開展CLPTM1L基因在肺癌放射治療中的作用和相關(guān)機(jī)制的研究，無疑將為提高肺癌放療的療效和針對性個體靶向基因的研究提供了新方向和新思路。因此，本研究在肺癌耐放射治療的機(jī)制、臨床肺癌患者放射治療的個體化治療以及放射治療療效評估的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究均具有重要的意義和研究價值。

利益沖突無

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Study of the impact of CLPTM1L on radiosensitivity of lung cancer

Zhao Shuyi,Chu Xiaofei,Liu Weili,Meng Qinghui,Cui Ming,Fan Saijun
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China(Zhao SY,Chu XF, Liu WL,Cui M,Fan SJ);Department of Oncology,Lombardi Comprehensive Cancer Center,Georgetown University, Washington DC 20097,USA(Meng QH)

ObjectiveTo study the correlation of cleft lip and palate transmembrane 1 like(CLPTM1L) expression and radiosensitivity of lung cancer cells.MethodsThiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)and cell colony formation assays were used to determine cell growth and survival.Western Blot assay was employed to measure protein expression.ResultsThe results demonstrated a negative correlation between the CLPTM1L expression level and radiosensitivity of lung cancer cells.A lower radiosensitivity in lung cancer cells containing high level of CLPTM1L expression,and vice versa.Enforced expression of CLPTM1L resulted in a significant reduction of radiosensitivity in lung cancer cells irradiated with γ-rays.On the contrary,a marked elevation of radiosensitivity was observed in lung cancer cells transfected with CLPTM1L siRNA.ConclusionsCLPTM1L may be a novel target gene in mediating radiosensitivity of lung cancer cells.

Cleft lip and palate transmembrane 1 like;Radiation tolerance;Lung neoplasms;γ-rays

樊賽軍，Email：fansaijun@irm-cams.ac.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．005

科技部科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項（2014EG150134）；國家自然科學(xué)基金（81172127，81572969）；天津科技支撐項目（14ZCZDSY00001）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所發(fā)展基金（1559，1549）Corresponding author:Fan Saijun,Email:fansaijun@irm-cams.ac.cn

2016-04-30）