陳卓 王海 肖寶 胡春艷 務(wù)圣潔 樊帆 秦玉 朱敦皖 張琳華

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·論著·

葉酸靶向載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒的制備及其體外細(xì)胞評(píng)價(jià)

陳卓 王海 肖寶 胡春艷 務(wù)圣潔 樊帆 秦玉 朱敦皖 張琳華

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的制備具有葉酸靶向性的載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒（PTX-FLPNPs），并研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT-6的細(xì)胞毒性及體外細(xì)胞吞噬。方法以聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PCL-PEG-PCL）、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇（DSPE-mPEG2000）和葉酸偶聯(lián)的磷脂（Folate-PEG（2000）-DSPE）為藥物載體，通過(guò)薄膜水化法自組裝制備PTX-FLPNPs，并對(duì)其進(jìn)行表征；使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察比較葉酸受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞EMT-6對(duì)葉酸靶向及無(wú)靶向雜化納米粒的吞噬作用；采用MTS法研究PTX-FLPNPs對(duì)EMT-6細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果成功制備了PTX-FLPNPs，其呈球形，粒徑均勻，具有明顯的“核-殼”結(jié)構(gòu)。投藥量為30%的PTX-FLPNPs的平均粒徑為（279.9±8.7）nm，多分散系數(shù)為0.173±0.021，Zeta電位為（-17.5±1.1）mV，載藥量為（27.36±0.91）%，包封率為（91.16±1.12）%。細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)表明，葉酸受體高表達(dá)的EMT-6細(xì)胞對(duì)葉酸靶向的雜化納米粒的吞噬作用明顯強(qiáng)于無(wú)靶向的雜化納米粒（P＜0.05）。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTX-FLPNPs的細(xì)胞毒性低于紫杉醇注射劑，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于無(wú)靶向的雜化納米粒。結(jié)論P(yáng)TX-FLPNPs具有較高載藥量及包封率，粒徑均勻，可通過(guò)主動(dòng)靶向作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，并增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，是一種能有效抑制腫瘤的靶向載藥納米制劑。

紫杉醇；磷脂-聚合物雜化納米粒；葉酸靶向；細(xì)胞吞噬；細(xì)胞毒性

Fund program:General Program of National Natural Science Foundation of China(81571793,51373199); Natural Science Foundation of Tianjin(15JCZDJC38300)

0 引言

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紅豆杉科紅豆杉屬植物紫杉的樹(shù)皮中分離得到的天然二萜類抗癌藥，主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌的臨床治療[1]。由于PTX在水中溶解度極低，臨床用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇等比例混合的溶劑溶解后給藥，但該助溶劑會(huì)引發(fā)嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)以及神經(jīng)毒性和腎毒性等不良反應(yīng)[2]。因此，設(shè)計(jì)更易被患者接受的PTX新型制劑以減少傳統(tǒng)助溶劑引發(fā)的毒副作用成為一個(gè)重要的研究方向，如脂質(zhì)體、微乳、納米粒及包合物等[3-7]。

磷脂-聚合物雜化納米粒（lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPNPs）是一種同時(shí)兼?zhèn)渲|(zhì)體及聚合物膠束優(yōu)點(diǎn)而避免兩者缺點(diǎn)的新型藥物載體[8]。LPNPs具有能增溶疏水性藥物的疏水性聚合物內(nèi)核；外層被磷脂層包裹，使其具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性以及體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)特性；表面還可用具有靶向能力的配體修飾獲得主動(dòng)靶向功能[9-10]。

葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是細(xì)胞增殖時(shí)參與堿基合成的必需維生素，其受體在多種癌細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)[11-12]，而在人體正常組織中的表達(dá)高度保守。葉酸具有無(wú)毒、無(wú)免疫原性、穩(wěn)定性好、與受體親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且通過(guò)葉酸與其受體的特異性結(jié)合，可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用攝取藥物[13]。因此，葉酸也成為目前應(yīng)用最多的用于主動(dòng)靶向修飾的配體[14-15]。

本研究采用聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PCL-PEG-PCL）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇（DSPE-mPEG2000）、偶聯(lián)葉酸的磷脂（Folate-PEG（2000）-DSPE）為藥物載體，通過(guò)薄膜水化法使其自組裝以制備具有葉酸靶向性的載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒（PTX-FLPNPs），研究腫瘤細(xì)胞對(duì)其的吞噬效果及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

PCL-PEG-PCL聚合物（PCL相對(duì)分子質(zhì)量為4 000 u，PEG相對(duì)分子質(zhì)量為8 000 u）（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所基因工程實(shí)驗(yàn)室合成），DSPE-mPEG2000、Folate-PEG（2000）-DSPE（美國(guó)Avanti Polar Lipids公司），PTX注射劑（6 mg/ml）（北京協(xié)和藥廠），PTX原料藥（純度＞99%）（中國(guó)重慶美聯(lián)制藥有限公司）,無(wú)葉酸的RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），尼羅紅（Nile Red，NR）（美國(guó)Sigma公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色液、微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green）、免疫熒光染色二抗稀釋液、免疫染色固定液、免疫染色洗滌液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），MTS試劑（美國(guó)Promega公司），其他試劑均為市售分析試劑。

Eyela N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化公司），VCX-130PB超聲波細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Sonics& Materials公司），J-25高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），Nano-ZS粒度分析儀（英國(guó)Malvern公司），Tecnai-F20透射電子顯微鏡（荷蘭FEI公司），高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography, HPLC）（美國(guó)Waters公司），LSM710全光譜型激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Carl ZEISS公司），F(xiàn)TS-3L真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)US Filter公司），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）。

1.2 方法

1.2.1 PTX-FLPNPs的制備

采用薄膜水化法進(jìn)行PTX-FLPNPs的制備。具體方法為：將PCL-PEG-PCL、PTX原料藥、DSPE-mPEG2000、Folate-PEG（2000）-DSPE（質(zhì)量比為70∶33∶7∶0.7）加入茄型瓶中，加適量二氯甲烷充分溶解，混合均勻，35℃下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑制成均勻薄膜，吹氮?dú)? min并抽真空過(guò)夜除去殘余有機(jī)溶劑。向茄型瓶中加入65℃去離子水并置于65℃環(huán)境中水化1h，然后冰浴中使用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)樣品超聲10 min，即得PTX-FLPNPs的分散液。使用高速冷凍離心機(jī)23 000 r/min離心30 min，收集沉淀并用去離子水重懸-離心洗滌3次，除去未包載藥物。冷凍干燥后得PTX-FLPNPs凍干粉。采用以上方法，在載體中不加入Folate-PEG（2000）-DSPE制備無(wú)靶向修飾的紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒（PTX-LPNPs）。

1.2.2 PTX-FLPNPs的表征

（一）平均粒徑及分布、Zeta電位的測(cè)定

室溫下取適量PTX-FLPNPs分散液，加去離子水將聚合物的質(zhì)量濃度稀釋至1 mg/ml，使用粒度分析儀對(duì)樣品平均粒徑及其分布、Zeta電位進(jìn)行測(cè)定，每項(xiàng)測(cè)定3次。

（二）形態(tài)觀察

取少量PTX-FLPNPs分散液滴至鋪有膜的銅網(wǎng)上，自然晾干，使用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)。（三）載藥量和包封率測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定PTX-FLPNPs的載藥量和包封率。精密稱取PTX-FLPNPs凍干粉5 mg，使用5 ml

乙腈溶解，并加入去離子水定容至10 ml，混合均勻后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾為樣品溶液備用。HPLC實(shí)驗(yàn)條件：反向C18色譜柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水（體積比為50∶50）；流速為1.0ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm；進(jìn)樣量為20 μl；柱溫為室溫。用HPLC測(cè)定溶液中PTX的峰面積，結(jié)合PTX標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載藥量與包封率。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞EMT-6培養(yǎng)于無(wú)葉酸的RPMI1640培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，質(zhì)量濃度為10 g/L的青霉素，10 g/L鏈霉素）中，在37℃、飽和濕度、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，維持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，備用。

1.2.4 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞吞噬研究

（一）熒光標(biāo)記的LPNPs的制備

（二）熒光顯微鏡觀察納米粒的攝取

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT-6細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使之貼壁生長(zhǎng)。然后吸棄培養(yǎng)基，分別加入用無(wú)血清的無(wú)葉酸RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml的NR-FLPNPs和NR-LPNPs。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，吸棄納米粒，將細(xì)胞固定，用微絲綠色熒光探針對(duì)細(xì)胞微絲進(jìn)行熒光染色，細(xì)胞核使用DAPI染色。最后，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)NR-FLPNPs和NR-LPNPs的吞噬效果。

（三）細(xì)胞攝取的定量研究

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT-6細(xì)胞，以每孔約5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于黑色96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁生長(zhǎng)；然后吸棄培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔加入上述0.25 mg/ml的NR-FLPNPs或NR-LPNPs分散液，陰性對(duì)照組則加入相同濃度的LPNPs分散液，陽(yáng)性對(duì)照組暫時(shí)不加任何納米粒；將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育0.5、2、24 h，隨后在陽(yáng)性對(duì)照組中加入0.25 mg/ml的NR-LPNPs分散液，并使用RIPA裂解液將各組細(xì)胞裂解，用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)552 nm、發(fā)射波長(zhǎng)636 nm下測(cè)定其熒光值。計(jì)算細(xì)胞對(duì)納米粒的吞噬率（%）

1.2.5 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞毒性研究

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT-6細(xì)胞，以每孔約5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組為PTX注射劑組（25 μg/ml）、PTX-FLPNPs組（PTX質(zhì)量濃度為25μg/ml）、PTX-LPNPs組（PTX質(zhì)量濃度為25μg/ml）、葉酸靶向的不載藥磷脂-聚合物雜化納米粒（FLPNPs）組；對(duì)照組為陰性對(duì)照組（有細(xì)胞，不加藥）和空白對(duì)照組（無(wú)細(xì)胞，不加藥）。將細(xì)胞培養(yǎng)板移入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，小心吸棄孔板內(nèi)的上清液。然后每孔加入100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀震蕩10 min，490 nm處測(cè)定吸光度（OD）值。按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率（%），并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，樣品間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

試驗(yàn)表明，傳統(tǒng)RBM算法在迭代次數(shù)達(dá)到70～80次時(shí)，RMSE達(dá)到了最低，也就是預(yù)測(cè)誤差率達(dá)到了最小，改進(jìn)的SRBM算法僅僅在迭代次數(shù)達(dá)到20次時(shí)，RMSE就已經(jīng)達(dá)到達(dá)到最低。試驗(yàn)結(jié)果表明改進(jìn)的SRBM算法比傳統(tǒng)的RBM算法評(píng)分預(yù)測(cè)效果更佳，能很好地提高評(píng)分預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，以及大大地降低推薦的工作量，為用戶提供更好的推薦。

2 結(jié)果與討論

2.1 PTX-FLPNPs的制備及表征

以PCL-PEG-PCL、Folate-PEG（2000）-DSPE、DSPE-mPEG2000共混物作為藥物載體材料，通過(guò)薄膜水化法自組裝制備了PTX-FLPNPs，并在疏水力作用下使疏水性藥物PTX均勻分散于疏水性PCL鏈段形成的內(nèi)核結(jié)構(gòu)中，從而將PTX載入FLPNPs。

PTX-FLPNPs的透射電鏡圖如圖1A所示，PTXFLPNPs呈球形，顆粒均勻，具有“蘑菇狀”的表面結(jié)構(gòu)。由于疏水性作用力，自組裝過(guò)程中PCL-PEG-PCL的PCL鏈段、Folate-PEG（2000）-DSPE和DSPE-mPEG2000的DSPE端以及PTX相互吸附、纏繞、包裹，形成雜化納米粒的內(nèi)核結(jié)構(gòu)，而各材料的PEG鏈段則留在雜化納米粒表面，形成親水性的外殼結(jié)構(gòu)。PTX-FLPNPs的這種“核-殼”結(jié)構(gòu)中，疏水性內(nèi)核起到增溶PTX的作用，親水性的外殼則可提高雜化納米粒的空間穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間且避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）吞噬，載藥納米粒通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（EPR）被動(dòng)靶向到腫瘤部位累積；與此同時(shí)，雜化納米粒表面修飾的葉酸結(jié)構(gòu)可與葉酸受體特異性結(jié)合，將載藥納米粒主動(dòng)靶向富集葉酸受體過(guò)度表達(dá)的腫瘤局部，并可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞作用攝取載藥納米粒。

用粒度分析儀對(duì)PTX-FLPNPs的平均粒徑及其分布、Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。如圖1B、1C所示，其平均粒徑為（279.9±8.7）nm，多分散系數(shù)為0.173±0.021，Zeta電位為（-17.5±1.1）mV。PTX-FLPNPs具有較小的多分散系數(shù)和較高的Zeta電位，表明采用本研究的制備方法可制備出粒徑較均一的載藥LPNPs，且雜化納米粒由于電荷排斥力不易聚集，可穩(wěn)定地分散于溶液中。

采用HPLC法測(cè)定PTX-FLPNPs的載藥量及包封率，結(jié)果表明，在PTX投藥量為30%時(shí)，PTX-FLPNPs具有較高的載藥量和包封率，其載藥量為（27.36± 0.91）%，包封率為（91.16±1.12）%。由此可見(jiàn)，F(xiàn)LPNPs可有效地增溶PTX。

2.2 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞吞噬研究

以脂溶性紅色染料NR代替PTX制備熒光標(biāo)記的NR-FLPNPs和無(wú)靶向性的NR-LPNPs，并使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并比較葉酸受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞EMT-6對(duì)NR-FLPNPs及NRLPNPs的吞噬作用及雜化納米粒在細(xì)胞中的定位。觀察前，對(duì)EMT-6細(xì)胞進(jìn)行固定，使用微絲綠色熒光探針（主要熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素（FITC））標(biāo)記細(xì)胞微絲，藍(lán)色熒光染料DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。

激光掃描共聚焦顯微鏡照片如圖2所示，行1為EMT-6對(duì)NR-FLPNPs的吞噬情況；行2為EMT-6細(xì)胞對(duì)NR-LPNPs的吞噬情況。對(duì)比可見(jiàn)，行1中EMT-6細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于行2，即葉酸受體高表達(dá)的EMT-6細(xì)胞對(duì)NR-FLPNPs的吞噬作用明顯強(qiáng)于NR-LPNPs。

進(jìn)一步的細(xì)胞攝取定量研究結(jié)果表明：EMT-6細(xì)胞與雜化納米粒共孵育0.5 h和2 h后，細(xì)胞對(duì)NR-FLPNPs的吞噬率約是對(duì)NR-LPNPs吞噬率的2倍（P＜0.05），說(shuō)明靶向分子明顯增強(qiáng)了雜化納米粒進(jìn)入靶細(xì)胞的能力；而共孵育24 h后，NR-FLPNPs和NR-LPNPs的細(xì)胞吞噬率相接近（P＞0.05），這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞已達(dá)到飽和，NR-FLPNPs與NR-LPNPs主要依靠其他非特異性的方式進(jìn)入細(xì)胞，故EMT-6細(xì)胞對(duì)這兩種納米粒的吞噬間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（表1）

由細(xì)胞吞噬的定性及定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)LPNPs可通過(guò)EMT-6細(xì)胞表面葉酸受體介導(dǎo)而大量被攝取進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，具有良好的主動(dòng)靶向性，可增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，提高療效，進(jìn)而降低藥物對(duì)其他組織的毒副作用。

表1 EMT-6細(xì)胞對(duì)兩種雜化納米粒的吞噬率（%）

圖3 紫杉醇質(zhì)量濃度均為25 μg/ml的各組在不同作用時(shí)間對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT-6的生長(zhǎng)抑制曲線

2.3 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞毒性研究

采用MTS法研究PTX-FLPNPs、PTX-LPNPs和FLPNPs對(duì)EMT-6細(xì)胞的毒性，并與臨床使用的PTX注射劑進(jìn)行比較。MTS試劑是一種用比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)試劑，其可被活細(xì)胞生物還原成一種可溶于培養(yǎng)基的有色甲臜產(chǎn)物，且顏色深淺與培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)量成正比，較傳統(tǒng)的噻唑藍(lán)（MTT）法更方便、快捷、靈活、安全。本研究中，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液（除FLPNPs組）所含PTX的質(zhì)量濃度均選為人體血漿中PTX可存在的最大質(zhì)量濃度[6]——25 μg/ml。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)EMT-6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線如圖3所示。FLPNPs組的細(xì)胞抑制率接近于0，表明磷脂-聚合物雜化納米粒只作為載體，本身對(duì)細(xì)胞并無(wú)毒性，載藥后其釋放出來(lái)的藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。培養(yǎng)24 h及48 h后，PTX注射劑組細(xì)胞抑制率顯著高于雜化納米粒組（P＜0.05）。培養(yǎng)72 h后，PTX注射劑組、PTX-FLPNPs組和PTX-LPNPs組的細(xì)胞幾乎完全被抑制生長(zhǎng)，3組細(xì)胞抑制率間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PTX-FLPNPs組及PTX-LPNPs組細(xì)胞抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，在培養(yǎng)24 h及48 h后，PTX-FLPNPs組的細(xì)胞抑制率高于PTX-LPNPs（P＜0.05）；而在培養(yǎng)72 h后，兩組的細(xì)胞抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在培養(yǎng)24 h和48 h后，PTX-FLPNPs組及PTX-LPNPs組的細(xì)胞抑制率均低于PTX注射劑組，此現(xiàn)象可能因PTX注射劑直接作用于細(xì)胞，而雜化納米粒中PTX需要從載體中釋放出來(lái)，使得在同一作用時(shí)間，培養(yǎng)液中的藥物濃度小于PTX注射劑。

3 結(jié)論

本研究成功地以PCL-PEG-PCL、DSPE-mPEG2000、Folate-PEG（2000）-DSPE為藥物載體，通過(guò)薄膜水化法自組裝制備了PTX-FLPNPs。研究結(jié)果表明，葉酸受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞EMT-6對(duì)FLPNPs的吞噬作用明顯強(qiáng)于LPNPs；且PTX-FLPNPs對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制效果，細(xì)胞毒性低于相同質(zhì)量濃度的PTX注射劑。因此，PTX-FLPNPs是一種可通過(guò)主動(dòng)靶向介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞作用而對(duì)其大量攝取，以增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，從而有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，并降低藥物對(duì)其他組織毒副作用的載藥納米制劑。

利益沖突無(wú)

（圖1、2見(jiàn)插頁(yè)3-4）

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Preparation and in vitro evaluation of folate-targeted lipid-polymer hybrid nanoparticles loaded with paclitaxel

Chen Zhuo,Wang Hai,Xiao Bao,Hu Chunyan,Wu Shengjie,Fan Fan,Qin Yu,Zhu Dunwan,Zhang Linhua
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Material,Tianjin 300192,China

Zhang Linhua,Email:elley2001@sina.com

ObjectiveTo prepare folate-targeted lipid-polymer hybrid nanoparticles loaded with paclitaxel (PTX-FLPNPs),evaluate its in vitro cellular uptake and cytotoxicity.MethodsPTX-FLPNPs composed of PCLPEG-PCL,DSPE-mPEG2000 and Folate-PEG(2000)-DSPE were prepared by thin-film hydration method,and characterized in terms of morphology,particle size and size distribution,drug loading and encapsulation efficiency. The uptake efficiency of FLPNPs in breast carcinoma cells EMT-6 was evaluated by confocal laser scanning microscopy.The cytotoxicity of PTX-FLPNPs against EMT-6 cells was determined by MTS assay.ResultsPTXFLPNPs showed spherical core-shell morphology with narrow size distribution.The PTX-FLPNPs with 30%drugloading content were found as spherical shape with average particle diameter of(279.9±8.7)nm,polydispersity index of(0.173±0.021),Zeta potential of(-17.5±1.1)mV,drug loading of(27.36±0.91)%and encapsulation efficiency of (91.16±1.12)%.The internalization efficiency of FLPNPs was obviously higher that of LPNPs in EMT-6 cells which overexpress folate receptor(P＜0.05).The cytotoxic effect of PTX-loaded FLPNPs was lower than that of PTX injection,but higher than that of PTX-loaded LPNPs(without folate conjugation).ConclusionsThe PTX-FLPNPs exhibits high drug-loading content and drug encapsulating efficiency,uniform size with narrow size distribution,high internalization efficiency in EMT6 cells by active targeting-mediated endocytosis.The PTX-FLPNPs would be a promising nanosized drug formulation for tumor-targeted therapy.

Paclitaxel;Lipid-polymerhybridnanoparticles;Folatetargeted;Cellularuptake;Cytotoxicity

張琳華，Email：elley2001@sina.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．001

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81571793，51373199）；天津市自然科學(xué)基金（15JCZDJC38300）

2016-03-20）