周勇軍，李龍平，王新華

(益陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南益陽(yáng) 413000)

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·臨床研究·

宮頸癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞介素-17水平及其相關(guān)性研究

周勇軍，李龍平，王新華

(益陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南益陽(yáng) 413000)

摘要:目的探討外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Tr細(xì)胞)和白細(xì)胞介素-17(IL-17)水平在宮頸癌患者中的變化及其相關(guān)性。方法選取2014年1月至2015年3月該院確診宮頸癌患者60例(宮頸癌組)和查體的健康女性60例(健康對(duì)照組)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Tr細(xì)胞數(shù)量及占CD4+細(xì)胞百分比，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IL-17水平。結(jié)果宮頸癌組外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比，F(xiàn)oxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T淋巴細(xì)胞比值及血清IL-17水平均較健康對(duì)照組明顯升高，而IL-17/Tr比值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。宮頸癌組患者外周血CD4+CD25+Tr細(xì)胞水平與血清IL-17水平呈正相關(guān)(r=0.768，P<0.05)。結(jié)論宮頸癌患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂，IL-17與Tr細(xì)胞比值失衡可能在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中起一定的作用。

關(guān)鍵詞:宮頸癌；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；白細(xì)胞介素-17

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。越來(lái)越多的研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Tr細(xì)胞)是一種新型免疫抑制細(xì)胞，能維持自身耐受和免疫穩(wěn)定，同時(shí)抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，其獨(dú)特的免疫抑制作用可能在腫瘤免疫逃逸中起了“主干”作用[1]。有研究表明，宮頸癌患者體內(nèi)存在CD4+CD25+Tr細(xì)胞比例失調(diào)，腫瘤負(fù)荷與宮頸癌患者體內(nèi)CD4+CD25+Tr細(xì)胞水平有關(guān)，提示CD4+CD25+Tr細(xì)胞表達(dá)異常參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[2]。炎癥和腫瘤之間可能存在一定的關(guān)系，慢性感染和炎癥能介導(dǎo)一系列炎性介質(zhì)(如細(xì)胞因子、酶、趨化因子等)一起造成炎癥微環(huán)境，被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。白細(xì)胞介素-17(IL-17)是輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)分泌的前炎性細(xì)胞因子，作為細(xì)胞核心的炎性因子具有強(qiáng)有力的誘導(dǎo)能力，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成，從而發(fā)揮促進(jìn)慢性炎癥和腫瘤生長(zhǎng)的作用[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)60例，宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞及IL-17水平的表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討IL-17和CD4+CD25+Tr細(xì)胞在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌的臨床免疫調(diào)節(jié)治療提供一定的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2014年1月至2015年3月本院婦科收治的經(jīng)臨床婦科檢查診斷和活檢后病理確診的初次就診宮頸癌患者60例，納入宮頸癌組，年齡32～79歲，平均(40.57±15.62)歲，所有患者無(wú)其他系統(tǒng)惡性腫瘤及轉(zhuǎn)移性腫瘤，未經(jīng)放、化療治療及內(nèi)分泌治療和免疫治療，取材前3 d內(nèi)無(wú)陰道沖洗及陰道用藥史。另選取本院查體的健康女性60例作為健康對(duì)照組，年齡26～75歲，平均(38.73±12.23)歲，均有性生活史，均為非妊娠狀態(tài)，均無(wú)子宮切除和宮頸手術(shù)史，均排除近期感染和自身免疫病史，均未使用糖皮質(zhì)激素和非甾體類(lèi)藥物。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)患者或其家屬同意，簽署知情同意書(shū)。兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具可比性。

1.2儀器與試劑熒光素標(biāo)記的單克隆抗體：異硫氰酸熒光素標(biāo)記CD4(CD4-FITC)、藻紅蛋白標(biāo)記CD25(CD25-PE)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記IgGI(IgGI-F1TC)和藻紅蛋白標(biāo)記IgGI(IgGI-PE)均購(gòu)自美國(guó)BD公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Linco公司。Beckman Coulter EP-ICS XL流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3方法

1.3.1外周血CD4+CD25+Foxp3+Tr細(xì)胞檢測(cè)取健康女性查體當(dāng)日和患者入院第2天清晨靜脈新鮮血液5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液得淋巴細(xì)胞，取分離的T淋巴細(xì)胞懸液100 μL，分別加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單克隆抗體各20 μL，同型對(duì)照分別為IgGI-F1TC、IgGI-PE，混勻，避光孵育25～30 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清。將細(xì)胞懸浮于0.5 mL PBS中，振蕩混勻后待測(cè)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌組和健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CD4+CD25+Foxp3+Tr細(xì)胞。

1.3.2IL-17檢測(cè)所有受試者清晨空腹抽取靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min，血清分離后放-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒測(cè)定血清IL-17水平，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果

2.1兩組外周血Tr細(xì)胞及血清IL-17水平比較宮頸癌組外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比及Foxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T淋巴細(xì)胞比值及血清IL-17水平均較健康對(duì)照組明顯升高，而IL-17/Tr比值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　　兩組外周血Tr細(xì)胞及血清IL-17水平比較±s)

2.2宮頸癌組外周血Tr細(xì)胞表達(dá)與血清IL-17水平的相關(guān)性分析將Tr細(xì)胞表達(dá)水平與血清IL-17水平進(jìn)行相關(guān)性分析，宮頸癌組患者血清IL-17水平越高，外周血CD4+CD25+Tr細(xì)胞表達(dá)水平越高，二者呈正相關(guān)(r=0.768，P<0.05)。

3討論

宮頸癌是發(fā)生在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞和宮頸管內(nèi)膜柱狀上皮細(xì)胞交界處的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。相關(guān)研究顯示，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素共同作用導(dǎo)致的，經(jīng)常規(guī)腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及化療得以有效緩解，但依然有相當(dāng)一部分患者存在復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能，從而影響卵巢癌的治療療效與預(yù)后，其中腫瘤免疫逃逸起“關(guān)鍵”作用，腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中演化出逃避免疫監(jiān)視的方式，導(dǎo)致宿主不能有效清除腫瘤。近年來(lái)的研究表明，CD4+CD25+Tr細(xì)胞是一群具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群，其主要通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞接觸、細(xì)胞溶解、競(jìng)爭(zhēng)性抑制、分泌抑制性細(xì)胞因子、間接抑制等方式發(fā)揮作用，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)定、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用，Tr細(xì)胞的免疫無(wú)能和免疫抑制使得腫瘤免疫逃逸，可能是腫瘤免疫逃逸中的關(guān)鍵因素[4-5]。近年來(lái)研究表明，肝癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥患者外周循環(huán)血中均發(fā)現(xiàn)Tr細(xì)胞增多，Tr細(xì)胞可通過(guò)抑制體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞活化從而抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，在維持腫瘤免疫耐受中發(fā)揮重要作用，Tr細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)[6]。Foxp3表面分子是叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子的總稱(chēng)，特異性表達(dá)在Tr細(xì)胞上，是Tr細(xì)胞的一個(gè)特異性標(biāo)志，Tr細(xì)胞活化可導(dǎo)致其表達(dá)Foxp3增加，F(xiàn)oxp3表達(dá)在Tr細(xì)胞的發(fā)育和功能上起重要作用[7]。IL-17是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種促炎細(xì)胞因子，是由活化的人CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，作為一種獨(dú)特的多效性細(xì)胞因子，晚期腫瘤患者的外周血及腫瘤組織中均可查見(jiàn)分泌IL-17的細(xì)胞，IL-17能促進(jìn)細(xì)胞增殖，并發(fā)揮著促進(jìn)新生血管生成的作用，通過(guò)促進(jìn)血管生成及腫瘤細(xì)胞的增殖，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。雖然，目前已經(jīng)有大量的研究證實(shí)Tr細(xì)胞能夠抑制T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，但是關(guān)于宮頸癌患者Tr細(xì)胞與IL-17表達(dá)水平的變化及兩者相互作用關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌患者Tr細(xì)胞與血清IL-17表達(dá)水平的變化，深入研究宮頸癌患者的免疫抑制機(jī)制，以期為宮頸癌患者尋找高效的免疫治療方案提供一定的理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組患者外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+細(xì)胞百分比，F(xiàn)oxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T比值，以及血清IL-17水平均較健康對(duì)照組明顯升高，而IL-17/Tr明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞數(shù)量升高可以反映腫瘤患者免疫系統(tǒng)存在抑制狀態(tài)，由此可能導(dǎo)致機(jī)體自身有效的免疫抑制功能增強(qiáng)，減弱了免疫監(jiān)視作用，在腫瘤的逃逸機(jī)制中發(fā)揮作用，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞，提示宮頸癌的發(fā)生與機(jī)體免疫狀態(tài)密切相關(guān)，尤其是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，宮頸癌機(jī)體處于一種潛在的免疫抑制狀態(tài)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17基因低甲基化導(dǎo)致IL-17高表達(dá)，IL-17能誘導(dǎo)腫瘤特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞的活性及功能增強(qiáng)，同時(shí)誘導(dǎo)抗腫瘤保護(hù)性免疫應(yīng)答的形成，從而發(fā)揮其抗腫瘤活性[9]。宮頸癌患者外周血Foxp3+Tr細(xì)胞與Tr細(xì)胞的比值較對(duì)照組明顯升高，表明Foxp3+Tr在宮頸癌細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，對(duì)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展起重要推動(dòng)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxP3表達(dá)在宮頸癌組織中增高，并與P16INK4a(人乳頭瘤病毒整合到宿主細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志)表達(dá)相關(guān)，與腫瘤大小呈正相關(guān)，表明FoxP3在宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[10]，與本研究相符。有研究表明，F(xiàn)oxP3+Tr介導(dǎo)的宮頸癌免疫逃逸與前列腺素E2(PGE2)密切相關(guān)，PGE2能誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-10(IL-10)的產(chǎn)生并抑制白細(xì)胞介素-12(IL-12)的產(chǎn)生，IL-10具有免疫抑制功能，而IL-12具有增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)功能，從而打破了免疫抑制與免疫效應(yīng)之間的平衡，使機(jī)體的免疫監(jiān)視功能下降，提示FoxP3的功能性高表達(dá)可能為導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的原因之一[11]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，IL-17表達(dá)水平與CCD4+CD25+Tr細(xì)胞表達(dá)水平呈正相關(guān)，IL-17水平越高，CD4+CD25+Tr細(xì)胞表達(dá)水平越高，表明血清IL-17在宮頸癌發(fā)病機(jī)制上發(fā)揮重要作用。Th17的主要效應(yīng)因子是IL-17，IL-17細(xì)胞和Tr細(xì)胞之間存在著反向分化的機(jī)制，Tr細(xì)胞的表達(dá)較IL-17細(xì)胞的表達(dá)升高更明顯，呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)表達(dá)，導(dǎo)致了IL-17/Tr比值呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明在宮頸癌患者中這種免疫平衡狀態(tài)被打破，導(dǎo)致了Th17細(xì)胞和Tr細(xì)胞表達(dá)水平升高，并且隨著腫瘤的發(fā)展而逐漸升高，這可能是宮頸癌發(fā)生的機(jī)制之一[12-13]。

綜上所述，CD4+CD25+Tr細(xì)胞和IL-17水平的升高可能參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能異常加劇IL-17/Tr失衡，從而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，在外周血中的水平可能成為監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)細(xì)胞免疫狀態(tài)和機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的指標(biāo)，在疾病的診斷、預(yù)后和腫瘤免疫治療中有很好的應(yīng)用前景。

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(收稿日期：2015-09-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.049

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0685-03