黃奕曦，沈志濱，江濤，陳艷芬，劉家媛，張莉莉，唐春萍

(廣東藥學(xué)院1.中藥學(xué)院； 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006)

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香鱗毛蕨有效部位對(duì)紅色毛癬菌體外抗真菌的作用

黃奕曦1，沈志濱1，江濤2，陳艷芬1，劉家媛1，張莉莉1，唐春萍1

(廣東藥學(xué)院1.中藥學(xué)院； 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 采用試管稀釋法和CLSI M38-A2微量液基稀釋法研究香鱗毛蕨有效部位(簡(jiǎn)稱DF)對(duì)紅色毛癬菌的體外抗真菌作用，并比較兩種方法的一致性。方法 利用兩種方法測(cè)定DF對(duì)紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株(6株)和臨床分離菌株(7株)的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MFC)。 結(jié)果 試管稀釋法測(cè)定DF對(duì)13株紅色毛癬菌的MIC范圍為生藥0.469～15.0 mg/mL；MFC范圍為生藥0.938～15.0 mg/mL。其中DF對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC范圍為生藥0.469～7.5 mg/mL，幾何均值為2.652 mg/mL，MFC范圍為生藥0.938～15.0 mg/mL，幾何均值為3.750 mg/mL。微量稀釋法測(cè)定DF對(duì)紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC范圍為生藥0.312 5～5.0 mg/mL，幾何均值為1.25 mg/mL；其MFC范圍為生藥1.25～20.0 mg/mL，幾何均值為5.0 mg/mL。 結(jié)論 香鱗毛蕨有效部位對(duì)紅色毛癬菌有抑菌作用和殺菌作用，兩種方法的測(cè)定結(jié)果有較好的一致性。

關(guān)鍵詞:香鱗毛蕨； 紅色毛癬菌； 試管稀釋法； 微量稀釋法； 最低抑菌濃度； 最低殺菌濃度

淺部真菌病是指皮膚、指甲、毛發(fā)發(fā)生的真菌感染，是臨床最常見(jiàn)的真菌病。人類淺部真菌病的致病病原菌中，紅色毛癬菌所占比例達(dá)90%[1]。隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素、抗腫瘤藥物等的長(zhǎng)期、廣泛以及不合理應(yīng)用，逐漸出現(xiàn)耐藥真菌菌株。因耐藥菌株感染導(dǎo)致的治療失敗與日俱增[2]。另外，一些抗菌藥物具有肝毒性[3]、腎毒性[4]等副作用，因此從傳統(tǒng)中草藥中尋求抗真菌有效部位和有效成分具有廣闊的研發(fā)前景。

香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott.為鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)鱗毛蕨屬(DryopterisAdans.)植物[5],在我國(guó)主要分布于東北地區(qū)。根據(jù)民間驗(yàn)方記載香鱗毛蕨對(duì)多種皮膚病(體癬、手足癬等)均有較好的治療效果[6]。近年國(guó)內(nèi)學(xué)者研究主要圍繞香鱗毛蕨的抗真菌活性成分篩選[7-8]，但其抗紅色毛癬菌物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚。為了明確香鱗毛蕨治療淺部真菌病的有效部位，本實(shí)驗(yàn)采用試管稀釋法和CLSI M38-A2微量稀釋法對(duì)多株紅色毛癬菌進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)香鱗毛蕨有效部位對(duì)紅色毛癬菌的抑菌作用，并比較兩種方法的一致性，為中藥體外抗真菌活性評(píng)價(jià)和香鱗毛蕨進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)菌株

紅色毛癬菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株6株和臨床分離株7株)和近平滑念珠菌(質(zhì)控菌株，編號(hào)ATCC22019)，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所(南京)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品

香鱗毛蕨采自中國(guó)黑龍江省，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教授鑒定為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物；大扶康(氟康唑氯化鈉注射液，輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：A434403)；瓊脂粉(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：39H108200)；葡萄糖(Genview，批號(hào)：3805010212)；蛋白胨(OXOID，批號(hào)：1113141)； RPMI Medium 1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)：1256837)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；PB-10酸度計(jì)(Sartorius)；血球計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

2方法

2.1香鱗毛蕨有效部位(簡(jiǎn)稱DF)貯備液的制備

由廣東藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室制備，香鱗毛蕨藥材用50%(φ)乙醇浸提，經(jīng)過(guò)濃縮、酸沉、離心分離后，得到浸膏，然后配制成含生藥質(zhì)量濃度2 g/mL的貯備液，其主要物質(zhì)成分為間苯三酚類化合物，經(jīng)紫外含量測(cè)定，總間苯三酚含量達(dá)到50%以上。無(wú)菌處理：用0.45 μm針式濾器過(guò)濾分裝貯備液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2試管稀釋法

2.2.1沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)的配制[8]稱取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、瓊脂18 g，量取蒸餾水1 000 mL置燒杯中攪拌混勻，并用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)整pH值至5.6±0.2。培養(yǎng)基分裝和密封后，進(jìn)行121 ℃高壓滅菌20 min。置于4 ℃冰箱備用保存。沙氏液體培養(yǎng)基[9]，除不加瓊脂外其他成分與制法同上。

2.2.2含藥培養(yǎng)基的制備將“2.2.1”沙氏瓊脂培養(yǎng)基分裝試管后高溫滅菌，待滅菌培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時(shí)，將香鱗毛蕨貯備液加入，混勻。將DF分成10個(gè)濃度梯度制成斜面，終質(zhì)量濃度分別為含生藥120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 mg/mL。取生長(zhǎng)對(duì)照管(陽(yáng)性對(duì)照)和空白瓊脂管(陰性對(duì)照)作對(duì)照。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2.2.3菌懸液的制備將受試菌株紅色毛癬菌接種于含沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)的培養(yǎng)皿上28 ℃培養(yǎng)7～10 d充分活化后，用接種環(huán)刮取已轉(zhuǎn)種活化的紅色毛癬菌，置于組織研磨器中，加入0.85%無(wú)菌生理鹽水，研磨均勻，經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌懸液濃度至1.0×106～6.0×106cfu/mL備用。

2.2.4最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定將已制備的菌液100 μL接種到含藥培養(yǎng)基和對(duì)照管培養(yǎng)基的表面，28 ℃孵育7～10 d后判讀結(jié)果。MIC值的判讀：在培養(yǎng)過(guò)程中由2人在自然光線下通過(guò)肉眼判讀。將每管生長(zhǎng)情況與對(duì)照管作比較，以最低藥物濃度無(wú)培養(yǎng)物生長(zhǎng)的藥基管為MIC終點(diǎn)，該藥物濃度即為該藥液對(duì)該種菌的MIC值，取3次濃度的平均值。

2.2.5最低殺菌濃度(MFC)測(cè)定[7]在“2.2.4”實(shí)驗(yàn)中無(wú)培養(yǎng)物生長(zhǎng)的藥基管加入經(jīng)滅菌的液體沙氏培養(yǎng)基，用接種環(huán)輕刮取藥基管斜面表面，充分振蕩后倒入無(wú)菌試管中。然后置于28 ℃孵育10～12 d進(jìn)行次代培養(yǎng)，觀察結(jié)果。MFC值的判讀：測(cè)定的液體培養(yǎng)基與空白對(duì)照管對(duì)比，若液體培養(yǎng)基清晰透亮，表示該MIC濃度完全抑制真菌生長(zhǎng)。若液體培養(yǎng)基渾濁，該MIC濃度未完全抑制真菌生長(zhǎng)；以最低藥物濃度無(wú)培養(yǎng)物生長(zhǎng)的液基管為MFC終點(diǎn)。

2.3微量稀釋法

2.3.1RPMI-1640培養(yǎng)基的配制[10]參照美國(guó)CLSI頒布的產(chǎn)孢絲狀真菌抗真菌藥敏試驗(yàn)方案(M38-A2)提供的方法進(jìn)行。

2.3.2燕麥培養(yǎng)基(oatmeal agar)的配制稱取燕麥片30 g，加水1 000 mL,煮沸30 min，用紗布過(guò)濾后補(bǔ)足水至1 000 mL,加瓊脂粉15 g溶化后分裝滅菌后使用。

2.3.3菌懸液的制備采用燕麥培養(yǎng)基對(duì)紅色毛癬菌進(jìn)行活化培養(yǎng)4～5 d，菌懸液配制操作同“2.2.3”。

2.3.4MIC的測(cè)定將“2.1”制備的DF用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成含生藥質(zhì)量濃度20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL 10個(gè)梯度濃度的含藥物的培養(yǎng)基液，然后由高至低依次在96孔板上第1～10列加入100 μL。第11列作為生長(zhǎng)對(duì)照加入RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL，第12列作為空白對(duì)照，加入RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL。紅色毛癬菌懸液用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度至2.0×103～6.0×103CFU/mL[11]，分別加入至96孔板第1～11列各孔100 μL，加蓋密封后置于35 ℃溫箱培養(yǎng)4 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀：只有當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照生長(zhǎng)良好且質(zhì)控菌株MIC在規(guī)定范圍內(nèi)，可由2人共同判讀，取無(wú)紅色毛癬菌生長(zhǎng)的孔作為最低藥物質(zhì)量濃度，即DF的MIC值。

2.3.5MFC的測(cè)定根據(jù)“2.3.4”的MIC測(cè)定的結(jié)果，取判讀后大于MIC的各孔中的液體100 μL，在無(wú)菌條件下接種于SDA培養(yǎng)基平皿，進(jìn)行次代培養(yǎng)，觀察是否有真菌長(zhǎng)出。

2.3.6質(zhì)量控制在每次測(cè)定的同時(shí)，在平行操作條件下進(jìn)行質(zhì)量控制。質(zhì)控(QC) 株采用經(jīng)培養(yǎng)活化的近平滑念珠菌(編號(hào)ATCC 22019)，質(zhì)控陽(yáng)性藥物為氟康唑，操作過(guò)程按照M38-A2方案中的要求進(jìn)行，QC株的MIC值結(jié)果在1.0～4.0 μg/mL范圍內(nèi)，視為測(cè)定結(jié)果有效可信。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1試管稀釋法

結(jié)果見(jiàn)表1。生長(zhǎng)對(duì)照管中的紅色毛癬菌覆蓋試管斜面，生長(zhǎng)良好。DF對(duì)13株紅色毛癬菌的MIC范圍為生藥0.469～15.0 mg/mL，幾何均值為3.750 mg/mL，其MFC范圍為生藥0.938～15.0 mg/mL，幾何均值為4.896 mg/mL。6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC幾何均值為生藥2.652 mg/mL，MFC幾何均值為生藥3.750 mg/mL。7個(gè)臨床菌株的MIC幾何均值為生藥5.047 mg/mL， MFC幾何均值為生藥6.153 mg/mL。由于不同菌株對(duì)DF的敏感性不同，故所呈現(xiàn)的MIC值也不同。

3.2微量稀釋法

結(jié)果見(jiàn)表2。生長(zhǎng)對(duì)照組紅色毛癬菌覆蓋96孔板的底部，生長(zhǎng)良好。DF對(duì)紅色毛癬菌的MIC范圍為生藥0.312 5～5.0 mg/mL，幾何均值為生藥1.25 mg/mL；其MFC范圍為生藥1.25～20.0 mg/mL，幾何均值為生藥5.0 mg/mL。

3.3兩種方法測(cè)定結(jié)果比較

通過(guò)采用試管稀釋法和CLSI M38-A2微量稀釋法兩種方法，測(cè)定DF對(duì)紅色毛癬菌的MIC和MFC值。結(jié)果顯示，測(cè)定的MIC值波動(dòng)在1～2個(gè)稀釋梯度內(nèi)，兩種方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。在標(biāo)準(zhǔn)菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中(見(jiàn)表1、表2)，試管稀釋法中比較敏感的菌株(MIC值較小)，在微量稀釋法中同樣敏感，即同一種菌株在兩種實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得的MIC值結(jié)果具有一定相關(guān)性。

表1　試管稀釋法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位對(duì)紅色毛癬菌的MIC值和MFC值

注：#為臨床分離株編號(hào)，其余為標(biāo)準(zhǔn)菌株編號(hào)；表中結(jié)果顯示為MIC/MFC，+表示有紅色毛癬菌生長(zhǎng)，-表示無(wú)紅色毛癬菌生長(zhǎng)。

表2　微量稀釋法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位對(duì)紅色毛癬菌的MIC值和MFC值

注：編號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)株編號(hào)；表中結(jié)果顯示為MIC/MFC，+表示有紅色毛癬菌生長(zhǎng)，-表示無(wú)紅色毛癬菌生長(zhǎng)。

表3　兩種方法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位對(duì)紅色毛癬菌抑制作用的比較

4討論

目前國(guó)內(nèi)研究中草藥抗真菌活性的實(shí)驗(yàn)方法，以試管稀釋法和微量稀釋法為主要研究方法[12]。試管稀釋法屬于瓊脂稀釋法的一種，準(zhǔn)確性較佳，重復(fù)性較好。由于真菌的生長(zhǎng)受藥物抑制出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象，可能會(huì)導(dǎo)致某些藥物的終點(diǎn)判斷困難[13]，而且試管稀釋法對(duì)受試藥量需求較大，不利于對(duì)中藥分離成分量小的單體探究。國(guó)內(nèi)學(xué)者主要采用試管稀釋法對(duì)香鱗毛蕨的活性成分進(jìn)行篩選[7-8]，而且實(shí)驗(yàn)中同種菌種的株數(shù)僅為單株，缺少菌株數(shù)量及其多樣性對(duì)藥物抗菌活性的影響研究。

2008年美國(guó) (CLSI)頒布了對(duì)酵母菌[14]和絲狀真菌[10]的微量稀釋法的標(biāo)準(zhǔn)化方案，研究者才開(kāi)始按照CLSI M38-A2微量液基稀釋法來(lái)研究藥物對(duì)皮膚癬菌的體外抗菌作用。微量稀釋法用量少，敏感度高，能在篩選單體過(guò)程中解決受制于從植物中分離提取單體的藥量不足影響。目前，國(guó)內(nèi)采用微量稀釋法研究香鱗毛蕨有效部位對(duì)真菌的體外抗真菌作用的報(bào)道較少，也未見(jiàn)采用CLSI M38-A2微量稀釋法研究香鱗毛蕨有效部位抗紅色毛癬菌作用研究的報(bào)道。本課題組采用了微量稀釋法研究發(fā)現(xiàn)DF對(duì)申克孢子絲菌和糠秕馬拉色菌有一定抑制作用[15-16]。王靜[17]采用微量稀釋法研究表明從香鱗毛蕨中分離出7個(gè)單體化合物中有3個(gè)單體對(duì)斷發(fā)毛癬菌和石膏樣小孢子菌有抑制作用。本研究首次采用微量稀釋法測(cè)定香鱗毛蕨有效部位(有效成分總間苯三酚含量達(dá)50%以上)對(duì)多株紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株的MIC值和MFC值，結(jié)果表明DF有較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用。

間苯三酚類是鱗毛蕨屬植物的主要特征化學(xué)成分，也是產(chǎn)生藥理活性的主要成分。大量實(shí)驗(yàn)表明該屬植物的抗微生物活性與間苯三酚的含量高存在密切相關(guān)[7,18-19]。本研究表明香鱗毛蕨有效部位(有效成分總間苯三酚含量達(dá)50%以上)有較強(qiáng)的抗真菌作用，推測(cè)總間苯三酚類可能是香鱗毛蕨主要的抑菌藥效物質(zhì)。有文獻(xiàn)報(bào)道采用微量法對(duì)真菌同一菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得的MIC 在2個(gè)濃度梯度內(nèi)，可認(rèn)為兩種方法測(cè)定的結(jié)果一致[20-21]。本實(shí)驗(yàn)以6株紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌為研究對(duì)象，比較試管稀釋法和微量稀釋法測(cè)定的結(jié)果， MIC值波動(dòng)在1～2個(gè)稀釋梯度內(nèi)，研究結(jié)果表明兩種方法的測(cè)定結(jié)果有一定的一致性。

由于皮膚癬菌的生長(zhǎng)特性各有不同，尤其是紅色毛癬菌，進(jìn)行紅色毛癬菌體外藥敏試驗(yàn)最重要的一環(huán)就是選擇能促進(jìn)分生孢子形成的培養(yǎng)基。夏修蛟[22]針對(duì)紅色毛癬菌的生長(zhǎng)特性在培養(yǎng)基方面進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)燕麥培養(yǎng)基比其他常用真菌培養(yǎng)基(如沙氏葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、玉米粉吐溫-80 ℃瓊脂等培養(yǎng)基)產(chǎn)孢更豐富。針對(duì)紅色毛癬菌產(chǎn)孢難的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)在使用微量稀釋法時(shí)曾采用SDA進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，產(chǎn)孢較少，改用燕麥培養(yǎng)基后所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定，產(chǎn)孢較多。另外，在確定了DF有效部位的基礎(chǔ)上，可通過(guò)對(duì)總間苯三酚類物質(zhì)進(jìn)行分離，尋找有效部位中的有效單體成分，從而進(jìn)一步探究香鱗毛蕨有效部位物質(zhì)基礎(chǔ)及其單體對(duì)紅色毛癬菌的抑制作用。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Antifungal effect of the active fraction ofDryopterisfragranson Trichophyton rubruminvitro

HUANG Yixi1,SHEN Zhibin1,JIANG Tao2,CHEN Yanfen1,LIU Jiayuan1,ZHANG Lili1,TANG Chunping1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.LaboratoryAnimalCenter,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To study the antifungal effect of the active fraction of Dryopteris fragrans (L.) Schott (DF) on Trichophyton rubrum by the test tube dilution and CLSI M38-A2 broth microdilution methods,and compare their consistency. Methods Two methods were used to detect the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicide concentration (MFC) against Trichophyton rubrum's 6 standard strains and 7 clinical isolates. Results The test tube dilution method determined the fungicidal activity of DF against Trichophyton rubrum,with the MIC values ranging from 0.469 to 15.0 mg/mL (for the crude herb) and the MFC values ranging from 0.938 to 15.0 mg/mL. Among the Trichophyton rubrum's standard strains,the MIC values ranged from 0.469 to 7.5 mg/mL (for the crude herb) and the geometric mean (GM) value of MIC was 2.652 mg/mL,while the MFC values ranged from 0.938 to 15.0 mg/mL and the GM value of MFC was 3.750 mg/mL. The broth microdilution method also showed the fungicidal activity of DF against Trichophyton rubrum’s standard strains. The MIC values ranged from 0.312 5 to 5.0 mg/mL (for the crude herb) and the GM value of MIC was 1.25 mg/mL,while the MFC values ranged from 1.25 to 20.0 mg/mL and the GM value of MFC was 5.0 mg/mL. Conclusion The active fraction of Dryopteris fragrans exerts antifungal effect against Trichophyton rubrum. Two detection methods show a proper consistency.

Key words:Dryopteris fragrans; Trichophyton rubrum; test tube dilution method; broth microdilution method; minimum inhibitory concentration; minimum fungicide concentration

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015102801

中圖分類號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1006-8783(2016)01-0078-05

作者簡(jiǎn)介：黃奕曦(1989—)，男，2013級(jí)碩士研究生，Email: hyx2288@qq.com；通信作者: 唐春萍(1966—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)研究，Email: tchp66@163.com。

基金項(xiàng)目：科技部“十二五”重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2011ZX09102-007-03)；廣東省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B030700044，2011A030100013)；廣州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(12A062131631)；2015年廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015A030302088)

收稿日期：2015-10-28

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-12 10:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160112.1037.002.html