張林杰，吳澤青，林勵，陳康，李靜

(廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

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生物誘導法所產沉香不同部位中3種色酮的含量測定

張林杰，吳澤青，林勵，陳康，李靜

(廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 測定生物誘導法所得沉香不同部位色酮類成分的質量分數(shù)，評價生物誘導法刺激結香的效果。方法 采用高效液相色譜法(HPLC法)測定生物誘導法誘導所得沉香不同部位中aquilarone B、aquilarone C及(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羥基-5,6,7,8-四氫色酮(CX16)的質量分數(shù)，色譜柱為waters symmetry shield C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%(體積分數(shù))H3PO4，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為234 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結果 Aquilarone B、aquilarone C、CX16分別在14.32～716、0.884～44.2、1.54～77 μg/mL范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。白木香木質部外側黑色結香部分(B部分)中，B1 樣品的aquilarone B、aquilarone C質量分數(shù)最高，分別為3.411 8、1.021 6 mg/g，B4樣品的CX16質量分數(shù)最高，為0.728 5 mg/g；而內側棕色初結香部分(Z部分)所測得色酮質量分數(shù)顯著低于B部分，其中Z1樣品的aquilarone B、aquilarone C質量分數(shù)最高，分別為1.424 9、0.585 9 mg/g，Z4樣品的CX16質量分數(shù)最高，為0.158 9 mg/g。結論 生物誘導法誘導所得沉香不同部位3種色酮的質量分數(shù)有較大差異，木質部外側黑色結香部分中3種色酮質量分數(shù)明顯高于內側棕色初結香部分，推測該法是由外而內誘導白木香木質部，逐步形成沉香藥材。

關鍵詞:生物誘導法； 沉香； 高效液相色譜法； 色酮

沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg含有樹脂的木材，味辛、苦、微溫，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效[1]，主要用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急[2]等癥。此外，沉香也是名貴香料的重要原料。白木香受到外界刺激后才能產生沉香，而且產量較低，傳統(tǒng)的人工結香方法如火燙法、砍傷法、打洞法等存在結香產量低、周期長、人工成本高等問題，導致市場上的優(yōu)質沉香資源稀缺。色酮為沉香的活性成分之一，已有報道從沉香中分離得到多種色酮類成分[3-8]，并建立了HPLC法測定沉香中2種色酮類成分質量分數(shù)的方法，吳澤青[9]等采用HPLC法測定了3種不同方法所形成沉香藥材中aquilarone B、aquilarone C等5種色酮的質量分數(shù)。生物誘導法是一種可在短期內誘導白木香結香的新方法[10]，然而所得藥材質量尚待評價。為此，筆者開展了本項研究，考察生物誘導法的結香效果及機制，以期為沉香誘導結香技術的發(fā)展提供一些試驗數(shù)據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters 2998PDA檢測器(美國Waters公司)；XS225A型電子天平(德國Precisa公司)；BP211D型電子天平(Sartorius公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2試劑

甲醇(AR，廣東光華化學試劑有限公司，批號：20120918)；H3PO4(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20120821)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)。aquilarone B、aquilarone C及(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羥基-5,6,7,8-四氫色酮(CX16)對照品(自制，經核磁質譜等方法測定，質量分數(shù)>98%)。

1.3材料

沉香藥材采自廣東省五華縣七輋徑沉香基地，其樹種經廣州中醫(yī)藥大學中藥學院實驗中心林勵研究員鑒定，為瑞香科沉香屬白木香Aquilariasinensis。2013年10月對基地4年樹齡白木香進行生物誘導法結香實驗，于2014年4月采白木香樹干中間木質部黑色部分，將其中80 cm長的1段平均分為20 cm的4段，自上而下依次編號為1～4，且將每段按照顏色(外黑、內棕黃)分成木質部外側黑色結香部分(B)和內側棕色初結香部分(Z)，分別編號為B1、Z1，B2、Z2，B3、Z3，B4、Z4。對照藥材為采自廣東省電白縣沉香基地的自然結香樣品。

2方法與結果

2.1混合對照品儲備溶液的制備

分別取aquilarone B、aquilarone C及CX16適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到aquilarone B、aquilarone C、CX16質量分數(shù)分別為7.16、0.442、0.77 mg/mL的混合對照品儲備溶液。

2.2供試品溶液的制備

取沉香藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置于50 mL平底燒瓶中，加入85%(體積分數(shù))甲醇12.5 mL，90 ℃水浴回流提取2次，每次1.5 h，濾過，合并濾液并定容至25 mL。0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為waters symmetry shield C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%(體積分數(shù)，下同)H3PO4，梯度洗脫，程序見表1；流速為1 mL/min；檢測波長為234 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL 。

分別精密吸取混合對照品儲備溶液、供試品溶液10 μL，分別按上述條件進樣測定。結果aquilarone B、aquilarone C與CX16色譜峰均能達到基線分離，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

2.4線性關系的考察

精密吸取混合對照品儲備溶液1 mL，至10 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，搖勻。再分別精密吸取上述溶液0.2、0.5、1、2、5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度(剩下的1.3 mL溶液直接作為1個質量濃度)，搖勻，配制成aquilarone B質量濃度分別為14.32、35.8、71.6、143.2、358、716 μg/mL，aquilarone C 質量濃度分別為0.884、2.21、4.42、8.84、22.1、44.2 μg/mL，CX16質量濃度分別為1.54、3.85、7.7、15.4、38.5、77 μg/mL的混合對照品溶液。過0.22 μm微孔濾膜，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，以各對照品的質量濃度(ρ，μg/mL)為橫坐標，峰面積積分值(A)為縱坐標進行線性回歸，得到各自的回歸曲線。3種色酮回歸方程見表2。

表1沉香中3種色酮成分的HPLC洗脫條件

Table 1HPLC elution conditions for 3 kinds of chromones in agarwood

t/minφ(乙腈)/%φ(0.1%H3PO4)/%01387282278312674413070473565654555808515841387851387

0.160.140.120.080.040.000.160.140.120.080.040.00051015202530t/min321BA321AUAU

1.aquilarone B； 2.CX16； 3.aquilarone C。

圖1混合對照品儲備溶液(A)、供試品溶液(B)的HPLC色譜圖

Figure 1HPLC results of mixed references(A) and the sample(B)

表2　沉香中3種色酮的線性回歸方程

2.5精密度試驗

取一定質量濃度(aquilarone B、aquilarone C、CX16質量濃度分別為716、44.2、77 μg/mL)的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.3”項下方法測定并記錄峰面積。結果aquilarone B、aquilarone C、CX16質量分數(shù)的RSD值分別為0.49%、0.78%、0.64%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6重復性試驗

取B1樣品約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.3”項下色譜條件測定，計算得aquilarone B、aquilarone C、CX16質量分數(shù)的RSD值分別為0.48%、0.67%、1.41%，表明方法重復性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取B1供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、32 h精密吸取10 μL，按“2.3”項下色譜條件進行測定，結果aquilarone B、aquilarone C、CX16峰面積的RSD值分別為0.35%、0.44%、0.66%，表明供試品溶液在32 h內穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗

分別取已知質量分數(shù)的B3樣品約0.5 g，精密稱定，平行操作6份，分別精密加入混合對照品溶液(aquilaroneB、aquilaroneC和CX16質量濃度分別為0.7、0.15、0.2 mg/mL)1 mL，按“2.2”項下方法提取供試品溶液，按“2.3”項下方法進行測定，計算回收率。結果見表3。

2.9樣品的測定

分別取9批樣品，各約1.0 g，精密稱定，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，采用外標法計算樣品中3種色酮的質量分數(shù)，結果見表4。

表3　沉香中3種色酮的加樣回收率試驗結果

表4　9批沉香樣品中3種色酮的質量分數(shù)測定結果

3討論

從本文結果可見，B部分3種色酮的質量分數(shù)明顯高于Z部分，B部分中aquilarone B、aquilarone C質量分數(shù)最高的均為B1，CX16質量分數(shù)最高的為B4；Z部分中，aquilarone B、aquilarone C質量分數(shù)最高的均為Z1，CX16質量分數(shù)最高的為Z4。與自然結香的沉香樣品相比，B部分和Z1部分的aquilarone B、aquilarone C質量分數(shù)均較高。

生物誘導法刺激所得沉香3種色酮質量分數(shù)較高，與自然結香的沉香藥材進行對比，B部分有2種色酮的質量分數(shù)均高于自然結香樣品，表明此新方法刺激所得沉香的質量較好；從不同部位來看，B部分以B1中色酮質量分數(shù)較高，Z部分以Z1中色酮質量分數(shù)較高，B部分的整體色酮質量分數(shù)高于Z部分，提示該法誘導沉香結香過程可能具有由外逐步向內的特點，Z部分可能是由白木到沉香形成過程的中間階段。本文通過對生物誘導法誘導結香藥材不同部位3種色酮質量分數(shù)的測定，為該新方法結香效果的評價提供了實驗數(shù)據(jù)，同時為其機制研究提供了參考依據(jù)。生物誘導法誘導白木香結香是一個復雜的過程，而對于所結沉香的質量評價及誘導結香機制的研究也是一個系統(tǒng)而復雜的工作，本文所做研究只是系列研究的一個組成部分，在后續(xù)的工作中會對其他相關方面開展進一步探究。

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(責任編輯：劉曉涵)

Determination of 3 kinds of chromones in different parts of agarwood by biology induction

ZHANG Linjie,WU Zeqing,LIN Li,CHEN Kang,LI Jing

(SchoolofChineseHerbalMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To determine the chromones′ contents in the agarwood generated by biology induction method and evaluate the effect of the new technology. Methods High performance liquid chromatography (HPLC) was used for the determination of aquilarone B,aquilarone C and (5S,6R,7R,8S)-2- [2- (4- methoxy-phenyl)-ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydro-chromones (CX16) in different parts of the agarwood. Waters Symmetry Shield C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm) was employed eluting gradiently with acetonitrile-0.1% phosphoric acid water. The flow rate was 1 mL/min,and the detection wavelength was 234 nm. The column temperature was 30 ℃,and the injection volume was 10 μL. Results The linear ranges of aquilarone B,aquilarone C and CX16 were 14.32-716,0.884-44.2,and 1.54-77 μg/mL,respectively. B1 sample contained the highest contents of aquilarone B (3.411 8mg/g) and aquilarone C (1.021 6 mg/g) among the knot incense part (part B) located outside of Aquilaria sinensis xylem,and the highest content of CX16 is 0.728 5 mg/g in B4 sample. The highest contents of aquilarone B (1.424 9 mg/g) and aquilarone C (0.585 9 mg/g) among the little knot incense part (part Z) located inside of Aquilaria sinensis xylem was in Z1 sample,and the highest content of CX16 is 0.158 9 mg/g in Z4 sample among part Z. Conclusion The contents of 3 chromones varied in different parts of the agarwood induced by biological stimulation. They were significantly higher in part B than in part Z. The new method might affect the xylem with generating agarwood gradually from outside to inside.

Key words:biologically induced method; agarwood; HPLC; chromones

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015092901

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0041-05

作者簡介：張林杰(1991—)，男，2013級碩士研究生，主要從事中藥炮制規(guī)范化及質量標準研究，Email：zhanglinjie1991@163.com；通信作者：林勵(1954—)，男，研究員，博士研究生導師，主要從事中藥資源開發(fā)與新藥研究，電話：020-39358270，Email：LL76611@126.com。

基金項目：國家發(fā)改委高技術產業(yè)化項目(2011-56)

收稿日期：2015-09-29

網(wǎng)絡出版時間：2016-01-15 18:24網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1824.007.html