吳立蓉，王秀鳳，高衛(wèi)東，唐小婭

(1.廣東藥學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 佛山 528000)

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藥物分析

超高效液相色譜法快速測(cè)定復(fù)方丹參片中皂苷類成分的含量

吳立蓉1，2，王秀鳳2，高衛(wèi)東3，唐小婭2

(1.廣東藥學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 佛山 528000)

摘要:目的 建立超高效液相色譜(UPLC)法測(cè)定復(fù)方丹參片中4種皂苷成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。方法 采用超高效液相色譜法，色譜柱為Acquity BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫為30 ℃。結(jié)果 復(fù)方丹參片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1在12 min內(nèi)獲得完全分離。各成分在定量范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系(r≥0.999)，平均回收率為98.9%～102.2%。結(jié)論 UPLC法與HPLC法同時(shí)測(cè)定同一批樣品，測(cè)得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果RSD值為0.01%。UPLC法提高了常規(guī)液相分析三七皂苷的速度，節(jié)約了溶劑。

關(guān)鍵詞:超高效液相色譜法； 復(fù)方丹參片； 皂苷

超高效液相色譜(UPLC)法近年來作為一種新技術(shù)，與傳統(tǒng)的高效液相色譜(HPLC)法相比，具有檢測(cè)快速、高靈敏度、高分離度的優(yōu)點(diǎn)，可大大縮短分析時(shí)間，同時(shí)減少溶劑用量以降低分析成本，目前在藥物分析、生化分析、食品及環(huán)境分析等領(lǐng)域應(yīng)用較廣。

復(fù)方丹參片由丹參、三七、冰片3味中藥組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，《中國(guó)藥典》法定測(cè)定其中4種皂苷類成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用普通高效液相色譜法，耗時(shí)100 min，分析時(shí)間長(zhǎng)、效率低[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道采用UPLC法測(cè)定復(fù)方丹參片中3種皂苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[2]，但是按照《中國(guó)藥典》規(guī)定[1]，只3種成分的測(cè)定無法用于復(fù)方丹參片在生產(chǎn)流通過程中的質(zhì)量控制,無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此本研究參照文獻(xiàn)[3-5]，采用UPLC法測(cè)定復(fù)方丹參片中4種皂苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，約10 min可以完成整個(gè)測(cè)定過程，極大地縮短了時(shí)間，提高了分析效率，可以在藥品生產(chǎn)過程中產(chǎn)品質(zhì)量控制以及藥品流通過程中監(jiān)督檢驗(yàn)等方面產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。

1儀器與試藥

Waters Acquity UPLC系統(tǒng)(四元泵處理器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器)；Millipore超純水機(jī)(美國(guó)默克密理博公司)。

三七皂苷R1(批號(hào)：110745-200414)、人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-201128)、人參皂苷Re(批號(hào)：110754-201123)、人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-201122)對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純(Merck公司)，水為超純水。

復(fù)方丹參片(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：3140918)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Acquity BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)； 流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。梯度洗脫程序見表1，色譜圖見圖1，各成分分離度皆大于1.5。

表1復(fù)方丹參片中4種皂苷類成分測(cè)定的梯度洗脫表

Table 1Gradient elution of four components in compound Salvia tablets

t/minφ(乙腈)/%φ(H2O)/%0.00～2.0082.018.02.00～5.0082.0→80.018.0→20.05.00～11.0080.0→60.020.0→40.011.00～11.1060.0→82.040.0→18.011.10～12.0082.018.0

AB0.080.060.040.020.000.080.060.040.020.0043211234024681012t/minAUAU

1.三七皂苷R1； 2.人參皂苷Rg1； 3.人參皂苷Re； 4.人參皂苷Rb1。

圖1混合對(duì)照品(A)、復(fù)方丹參片供試品(B)溶液的UPLC色譜圖

Figure 1UPLC chromatograms of mixed references(A) and compound Salvia tablets(B)

2.2混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1適量，加70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇制成每1 mL含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1分別為0.050、0.200、0.051、0.202 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備

取復(fù)方丹參片10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量。超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系的考察

分別精密稱取對(duì)照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1適量，加70%甲醇制成每1 mL含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1分別為0.20、0.40、0.20、0.40 mg的混合對(duì)照品溶液，備用。精密量取上述對(duì)照品混合溶液各1、2、4、6、8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度。分別精密吸取1 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次。以對(duì)照品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的回歸方程分別為Y1=6.120 08×105X1+3.619 1×102，r1=0.999 5；Y2= 5.912 95×105X2+1.492 2×102，r2=0.999 9；Y3= 6.867 12×105X3-1.415 7×102，r3=0.999 7；Y4=5.081 59×105X4+9.619 1×102，r4=0.999 9。結(jié)果表明4種皂苷類成分進(jìn)樣量分別在0.02～0.16 μg、0.04～0.32 μg、0.02～0.16 μg、0.04～0.32 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件重復(fù)測(cè)定5次，分別計(jì)算4種成分的峰面積積分值。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值分別為0.09%、0.04%、0.08%、0.04%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批(批號(hào)：3140918)復(fù)方丹參片，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共5份，每份平行測(cè)定2次，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定并計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.13%、0.95%、1.01%、1.00%。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批(批號(hào)：3140918)供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定并計(jì)算各成分峰面積的RSD值，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為0.40%、0.15%、0.37%、0.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取復(fù)方丹參片粉末6份，每份約0.5 g，精密稱取，加入三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別0.25、1.0、0.1、0.8 mg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果測(cè)得回收率為98.85%～102.24%，RSD值為1.12%～1.99%。見表2。

2.9UPLC法與HPLC法測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

取復(fù)方丹參片樣品適量，分別按上述UPLC法與HPLC法[1]測(cè)定其中4種皂苷類成分的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平行測(cè)量7次。測(cè)定結(jié)果見表3。

表2　復(fù)方丹參片中4種皂苷類成分的回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3UPLC法與HPLC法測(cè)定復(fù)方丹參片中4種皂苷類成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果比較

Table 3Determination results of four saponins with UPLC and HPLC in compound Salvia tablets

w/(mg·g-1)

采用兩樣本均值間的t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)公式：

(1)

(2)

計(jì)算，得t=0.431。查t檢驗(yàn)臨界值表得知，雙側(cè)檢驗(yàn)t0.05,10=2.228，t

3討論

為保證與《中國(guó)藥典》規(guī)定的一致性，本試驗(yàn)的供試品溶液提取方法、測(cè)定波長(zhǎng)與藥典規(guī)定一致，同時(shí)考察了色譜條件的流動(dòng)相組成、柱溫和流速等。用所建立的UPLC法測(cè)定復(fù)方丹參片中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，符合藥典要求。

比較了UPLC法與HPLC法所測(cè)樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計(jì)分析得知，這2種分析方法所測(cè)得的均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此可用UPLC法替代HPLC法測(cè)定復(fù)方丹參片中4種皂苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

與藥典增補(bǔ)方法需要的100min相比，本UPLC法極大地縮短了時(shí)間，提高了分析效率，在12min內(nèi)即可將復(fù)方丹參片中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb14種待測(cè)成分完全分離，可以代替常規(guī)HPLC法進(jìn)行測(cè)定，在藥品生產(chǎn)過程產(chǎn)品質(zhì)量控制以及藥品流通過程監(jiān)督檢驗(yàn)等方面產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Simultaneous determination of four components in compound Salvia tablets by UPLC analysis

WU Lirong1，2,WANG Xiufeng2,GAO Weidong3,TANG Xiaoya2

(1.InstituteofPharmaceuticalBioactiveSubstanceResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;3.FoshanCenterforFoodandDrugControl，F(xiàn)oshan528000，China)

Abstract:Objective To develop a novel and rapid method with ultra-performance liquid chromatography for the simultaneous determination of four saponins in compound Salvia tablets. Methods An acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) was used. Acetonitrile and water were adopted with gradient elution of 0.5 mL/min,and the detection wavelength was 203 nm. The column temperature was 30 ℃. Results Notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1,Re and Rb1 in compound Salvia tablets had good linearity. And the average recoveries were among 98.9%-102.2% (n=6). Conclusion The relative deviation of the content was 0.01% when UPLC and HPLC was used to determine the same sample. UPLC could greatly improve the separation efficiency and reduce the solvent consumption. As an alternative of conventional HPLC,UPLC is more convenient,rapid and feasible.

Key words:UPLC； compound Salvia tablets；saponins

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110201

中圖分類號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):1006-8783(2016)01-0032-04

作者簡(jiǎn)介：吳立蓉(1980—)，女，博士，副研究員，主要從事中藥復(fù)方抗衰老及藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，Email：30872950@qq.com；通信作者：唐小婭(1980—)，Email：526325348@qq.com。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81403153)；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020212603)

收稿日期：2015-11-02

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-15 18:36網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1836.010.html