蔡劉體，陸 寧，沈子霞，石俊雄

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽(yáng)550081；2.貴州省煙草公司遵義縣公司，貴州遵義563003）

煙草青枯菌FQY＿4宿主特異性候選基因分析

蔡劉體1，陸 寧1，沈子霞2，石俊雄1

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽(yáng)550081；2.貴州省煙草公司遵義縣公司，貴州遵義563003）

為青枯菌與煙草的相互作用研究提供宿主特性候選基因，在煙草青枯菌FQY＿4基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，采用基因組及同源基因比較，分析青枯菌株系GMI1000、Po82、CFBP2957、CMR15、PSI07和FQY＿4的核心基因及FQY＿4宿主特異性候選基因。結(jié)果表明：FQY＿4基因組中有632個(gè)宿主特異性候選基因，其中染色體、巨大質(zhì)粒分別有365個(gè)和267個(gè)，包括跨膜蛋白、信號(hào)蛋白和細(xì)胞壁水解相關(guān)的基因，移動(dòng)元件蛋白和許多未知功能的蛋白基因，以及宿主特異性候選三型分泌系統(tǒng)的42個(gè)效應(yīng)蛋白因子（T3Es）。

煙草；青枯菌；青枯病；宿主；基因

青枯菌〔Ralstonia solanacearum（Pseudomonas solanacearum）〕是一種土傳性的細(xì)菌性病原菌，屬于革蘭氏陰性菌。青枯菌種性非常復(fù)雜［12］，按照種系型（Phylotype）劃分框架及對(duì)應(yīng)的地理起源信息，青枯菌可分為4個(gè)種系型：種系型Ⅰ和Ⅱ分別由亞洲和美國(guó)菌株組成，種系型Ⅲ的成員由非洲菌株組成，種系型Ⅳ包括來(lái)自印度尼西亞和澳大利亞的R.syzygii和BDB［23］。

青枯菌是一個(gè)復(fù)雜的種，遺傳多樣性豐富［45］，青枯菌宿主眾多，包含50多個(gè)科中的200多種植物，其中包括重要的農(nóng)作物烤煙、馬鈴薯、西紅柿、辣椒和香蕉等［67］。由青枯菌侵染導(dǎo)致的煙草青枯病是危害煙草的主要病害之一［8］，在與宿主相互作用的長(zhǎng)期進(jìn)化中，形成了宿主適應(yīng)性的一些特異性基因。

在病原菌－宿主相互作用的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，青枯菌復(fù)雜種獲得了一些宿主特異性基因。Genin［9］綜述了青枯菌株系適應(yīng)植物寄主的分子特征，包括青枯菌適應(yīng)宿主進(jìn)化過(guò)程中獲得或丟失的三型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白因子。Guidot等［10］通過(guò)多宿主演化試驗(yàn)研究了青枯菌適應(yīng)植物宿主的相關(guān)基因，包括青枯菌在適應(yīng)的宿主起作用的efpR基因，Ailloud等［11］通過(guò)基因組比較方法分析了宿主分別為香蕉和馬鈴薯青枯菌株系的宿主特異性候選基因。

隨著生物技術(shù)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)已經(jīng)報(bào)道青枯菌多個(gè)株系的全基因組的測(cè)序，包括青枯菌株系GMI 1000［12］、Po 82［13］和CFBP 2957［14］等，這些青枯菌株系全基因組測(cè)序信息的解析和積累，有助于分析青枯菌復(fù)雜種中株系宿主的特異性基因，有助于青枯菌與其宿主相互作用的研究。為給青枯菌與煙草的相互作用研究提供宿主特性候選基因，在完成FQY＿4基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因組比較分析了FQY＿4基因組中宿主特異性候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草青枯菌FQY＿4，全基因組序列通過(guò)Hiseq 2 000高通量測(cè)序完成，F(xiàn)QY＿4基因組在GenBank的登錄號(hào)分別是CP004012和CP004013［15］。其他青枯菌株系的種系型及基因組信息從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取（表1）。

表1 青枯菌株系種系型及宿主信息Table1 The phylotypes and hosts information of R.solanacearumstrains

1.2 基因組比較分析

基因組比較及煙草青枯菌FQY＿4基因組和巨大質(zhì)粒上宿主特異性基因分析采用OMA algorithm和honology blast比較法；煙草青枯菌FQY＿4三型分泌系統(tǒng)的宿主特異性效應(yīng)蛋白因子分析采用ScanYourGenome（網(wǎng)址：http：／／iant.toulouse.inra.fr／T3E）和T3Es數(shù)據(jù)庫(kù)分析比對(duì)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 FQY＿4基因組染色體上宿主特異性候選基因

從圖1可看出，不同演化型的青枯菌6個(gè)株系具有核心基因2 932個(gè)，但是也有菌株自身特有的基因，特異性基因數(shù)目因青枯菌株系的不同而存在差異，其中菌株P(guān)SI07有自身特異性基因407個(gè)。這些特異性基因可能是在病原菌－宿主相互作用的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成，也是宿主特異的候選基因。由表2可知，煙草青枯菌FQY＿4染色體上具有365個(gè)宿主特異性候選基因，其中包括與青枯菌侵染宿主相關(guān)的跨膜蛋白、信號(hào)蛋白和細(xì)胞壁水解相關(guān)的酶，還有許多功能未知的蛋白。

2.2 FQY＿4巨大質(zhì)粒上宿主特異性候選基因

從圖2看出，5個(gè)青枯菌株系的巨大質(zhì)粒共有的核心基因數(shù)有928個(gè)，特異性基因數(shù)目因青枯菌株系的不同有差異，煙草青枯菌FQY＿4有自身特異性基因267個(gè)，與同是種系型I的GMI 1000株系的巨大質(zhì)粒自身特有基因數(shù)目（261個(gè)）相差較小。由表3可知，煙草青枯菌FQY＿4巨大質(zhì)粒上宿主特異性候選基因包括與侵染宿主相關(guān)的多糖降解酶、效應(yīng)蛋白因子及許多未知功能的蛋白。

圖1 青枯菌株系（6個(gè)）染色體基因組核心基因Fig.1 The core genes on chromosome of six R.solanacearumstrains

表2 部分青枯菌FQY＿4基因組上部分宿主特異性候選基因信息Table2 Part of candidate genes on chromosome of FQY＿4strains for host specificity

圖2 青枯菌株系（5個(gè)）巨大質(zhì)?；蚪M核心基因示意圖Fig.2 The core genes on huge plasmid of five R.solanacearumstrains

表3 部分青枯菌FQY＿4巨大質(zhì)粒上宿主特異性候選基因信息Table3 Part of candidate genes on huge plasmid of FQY＿4strains for host specificity

表4 青枯菌株系的T3Es數(shù)目比較Table4 The comparison of T3Es number in different R.solanacearumstrains

表5 煙草青枯菌FQY＿4的宿主特異性候選T3Es信息Table5 The information of candidates T3Es in R.solanacearumFQY＿4for host specificity

2.3 三型分泌系統(tǒng)中宿主特異性效應(yīng)蛋白因子

青枯菌三型分泌系統(tǒng)中有豐富的效應(yīng)蛋白因子（T3Es）［17］，不同種系型的青枯菌株系有T3Es 60～90個(gè)，其中核心T3Es有32個(gè)［1718］。從表4可知，煙草青枯菌FQY＿4有宿主特異性候選T3Es 42個(gè)。由表5可知，煙草青枯菌FQY＿4的宿主名稱(chēng)、位置信息和部分功能信息。從功能角度看，部分T3Es具有酶的功能，如乙酰轉(zhuǎn)移酶、泛素連接酶和果膠裂解酶等，由此推測(cè)較多的核心T3Es功能可能與青枯菌復(fù)雜種的進(jìn)化過(guò)程有關(guān)，但大部分T3Es的功能尚有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證，尤其是其中的假基因拷貝是否有其他生物學(xué)功能或作用，目前仍不清楚。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同宿主的青枯菌株系的宿主特異性候選基因數(shù)有較大差異，F(xiàn)QY＿4染色體上有632個(gè)候選基因（染色體上有365個(gè)，巨大質(zhì)粒上有267個(gè)），而同是種系型I但宿主不同的GMI 1000株系宿主特異性候選基因?yàn)?86個(gè)（染色體上25個(gè)，巨大質(zhì)粒上261個(gè)）；宿主同為西紅柿的青枯菌株系GMI 1000、CFBP 2957、CMR 15和PSI 07的宿主特異性候選基因數(shù)也有較大差異，說(shuō)明青枯菌對(duì)其宿主有其自身一些分子特征［9］。

青枯菌的三型分泌系統(tǒng)（the type III secretion system，T3SS）及效應(yīng)蛋白因子（effector proteins，T3Es）在青枯菌侵染致病過(guò)程中起重要作用［1921］。Genin等［20］預(yù)測(cè)青枯菌能產(chǎn)生70～80個(gè)T3Es，其對(duì)宿主的適應(yīng)性有較大貢獻(xiàn)，Ailloud等［11］分析了青枯菌核心T3Es中的14個(gè)效應(yīng)蛋白因子RipG5、RipB、RipW、RipAC、RipAB、RipR、RipE1、RipAM、RipAN、RipAY、RipAJ、RipF1、RipAI和PopC－like，說(shuō)明在青枯菌復(fù)雜種與其宿主的相互作用中，可能出現(xiàn)了數(shù)百次效應(yīng)蛋白因子的獲得和丟失事件。煙草青枯菌FQY＿4宿主特異性候選效應(yīng)蛋白因子是否在青枯菌與煙草相互作用的進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)獲得和丟失事件有待于進(jìn)一步分析和研究。

青枯菌宿主特異性基因的確定及其在于宿主相互作用中所起的作用，需要更多的不同種系型、不同地里起源及不同最適宿主的青枯菌株系的全基因組信息和數(shù)據(jù)提供支持。另外，青枯菌中致病基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的機(jī)理及功能，在培養(yǎng)基中已經(jīng)有大量的報(bào)道和闡述，但是在致病過(guò)程中，這些網(wǎng)絡(luò)調(diào)控在機(jī)理中的功能知之甚少［2223］。隨著越來(lái)越多不同種系型青枯菌株系測(cè)序的完成［2425］和青枯菌眾多致病因子及其調(diào)控途徑和網(wǎng)絡(luò)的闡明［2627］，預(yù)計(jì)能更有效地獲得青枯菌這個(gè)復(fù)雜種中的核心基因和各自的宿主特異性基因，為青枯菌與其宿主相互作用的研究提供更多的基因信息。

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（責(zé)任編輯：孫小嵐）

Analysis of Candidate Genes of Ralstonia solanacearum FQY＿4for Host Specificity

CAI Liuti1，LU Ning1，SHEN Zixia2，SHI Junxiong1
（1.Guizhou Tobacco Research Institute，Guiyang，Guizhou550081；2.Zunyi Branch of Guizhou Tobacco Company，Zunyi，Guizhou563003，China）

In order to obtain the candidate genes of tobacco R.solanacearumfor host specificity，based on the sequenced genome of FQY＿4，the core genes and special genes of GMI1000，Po82，CFBP2957，CMR15，PSI07and FQY＿4strains were analyzeDThrough the methods of genome comparative and homology blast.The results showeDThat there are 632candidate genes for its host specificity in the FQY＿4genome.Among them 365and 267candidate genes on its chromosome and huge plasmid respectively，including the genes relateDTo trans－membrane proteins，signal proteins and cell wall hydrolysis，the genes relateDTo mobile element proteins，many unknown functional proteins and 42effector proteins（T3Es）.

tobacco；Ralstonia solanacearum；bacterial wilt；host；gene

S572

A

1001－3601（2016）10－0411－0005－04

2016－04－25；2016－09－27修回

中國(guó)煙草總公司項(xiàng)目“煙株根際土壤微生物施肥響應(yīng)及調(diào)控技術(shù)研究”（11020142009）；中國(guó)煙草總公司貴州省分公司項(xiàng)目“煙草青枯菌致病基因家族分析”（黔煙合201203），“青枯菌噬菌體的篩選及其防控?zé)煵萸嗫莶〉奶剿鳌保ㄇ瓱熀?01203）

蔡劉體（1974－），男，副研究員，博士，從事土肥植保工作。E－mail：cailiuti01＠163.com