王曉靜++李成奇++張金寶++王清連

摘要：以棉花抗病材料Arcot-1與感病材料Arcot-438為研究對象，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）研究棉花黃萎病菌侵染棉花后其根系內(nèi)茉莉酸、水楊酸激素的動態(tài)變化。結(jié)果表明，無論是抗病還是感病材料，棉花黃萎病菌的侵入都導(dǎo)致根系茉莉酸、水楊酸含量在一定范圍升高；在接種條件下，抗病、感病材料中2種激素含量最高值出現(xiàn)的時間都早于未接種條件，說明茉莉酸、水楊酸的含量隨病害程度變化而不同；抗病材料中2種激素峰值出現(xiàn)的時間都早于感病材料，說明抗病材料可能比感病材料更早地開始抑制病菌侵入。

關(guān)鍵詞：棉花；黃萎病菌；茉莉酸；水楊酸；動態(tài)變化；抗病機制

中圖分類號： S435.621.2+4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0141-02

收稿日期：2015-01-07

基金項目：國家轉(zhuǎn)基因重大專項（編號：2012ZX08013007）；河南省棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（編號：S2013-07、Z2013-07-01）。

作者簡介：王曉靜（1989—），女，河南南樂人，碩士研究生，從事棉花抗病育種研究。E-mail：15137333232@163.com。

通信作者：王清連，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事棉花遺傳育種研究。E-mail：wangql985@163.com。棉花黃萎病菌通過侵染植株的維管束，使其變成灰色、深褐色，從而影響棉花輸導(dǎo)組織的正常運行，導(dǎo)致發(fā)病時葉黃、葉落，嚴重的可使蕾鈴脫落、棉株枯萎而死[1]。多年來，棉花黃萎病發(fā)生日趨嚴重，只有對其致病機制進行不斷深入研究，才能找到有效預(yù)防與控制病害發(fā)展的方法[2]。棉花黃萎病抗性與體內(nèi)的多糖、激素、氨基酸及根部分泌物有關(guān)[3]，而激素在這個過程中起著非常重要的作用。在病原菌侵染條件下，乙烯、脫落酸含量增加，而赤霉素、激肽等含量降低[4-6]。植物激素茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid，SA）是近年來發(fā)現(xiàn)的植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控因子[7-8]，在植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著重要角色[9]。在黃萎病菌脅迫條件下，研究棉花茉莉酸、水楊酸含量的動態(tài)變化，對深入理解棉花抗黃萎病機制、通過有效調(diào)控激素水平提高棉花整體抗性具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為抗黃萎病材料Arcot-1和感黃萎病材料 Arcot-438，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。

1.2試驗方法

1.2.1播種和接種選擇成熟飽滿的上述材料籽粒，硫酸脫絨。2014年4月30日種植于河南科技學(xué)院棉花育種試驗田；5月30日，即棉苗長到5～6張真葉時，分別對2種材料的90株植物進行黃萎病菌種接種，90株未接種。接種參照石磊巖等方法[10]。

1.2.2取樣方法在接種后的 1、3、7、15、45 d，同時隨機選擇10株接種、未接種的材料，挖取根系，洗凈、擦干、編號，液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3樣品預(yù)處理將凍存的根系樣品取出，迅速稱取1 g放入預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨磨碎；加入1 mL甲醇充分研磨后，加入8 mL PBS（pH值7.4，0.1 mmol/L），用80%甲醇配平后離心得到10%的勻漿液；將10%勻漿液于3 000 r/min離心 20 min，收集上清液，分裝后留1份待檢測，其余冷凍備用。

1.2.4激素測定采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定水楊酸、茉莉酸含量。利用芬蘭（Labsystems Multiskan MS）352型酶標儀測定D值，根據(jù)測得的D值計算得出樣品對應(yīng)的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1抗病、感病材料根系茉莉酸含量動態(tài)變化

對抗病材料Arcot-1和感病材料Arcot-438進行根系茉莉酸含量動態(tài)變化的分析，由圖1-A可知，在未接種黃萎病菌的條件下，抗病材料Arcot-1根系的茉莉酸含量存在2個峰值，第1個峰值出現(xiàn)在處理后3 d，含量最高，第2個峰值出現(xiàn)在處理后15 d，處理后45 d含量最低。在接種黃萎病菌條件下，Arcot-1根系的茉莉酸含量變化也存在2個峰值，第1個峰值出現(xiàn)在處理后1 d，含量最高，之后迅速下降；處理后3 d含量達到最低值，之后升高；處理后15 d出現(xiàn)第2個峰值，之后又下降；處理后45 d含量與未接種時接近。

由圖1-B可知，在未接種黃萎病菌條件下，感病材料Arcot-438根系茉莉酸含量在處理1 d時出現(xiàn)第1個峰值，在處理15 d時出現(xiàn)第2個峰值且含量最高，在處理3 d時含量最低。在接種病菌的條件下，Arcot-438根系內(nèi)茉莉酸含量在處理后1～7 d 持續(xù)升高，處理7 d時含量出現(xiàn)峰值，以后持續(xù)下降；處理45 d時含量最低，與未接種接近。

2.2抗病和感病材料根系水楊酸含量動態(tài)變化

對抗病材料Arcot-1和感病材料Arcot-438進行根系水楊酸含量動態(tài)變化分析。由圖2-A可知，在未接種黃萎病菌條件下，抗病材料Arcot-1根系內(nèi)水楊酸含量在處理 3 d 時出現(xiàn)峰值，之后持續(xù)降低，直到45 d時含量最低；在接種黃萎病菌條件下，Arcot-1根系的水楊酸含量存在2個峰值，分別在處理后1、15 d，其動態(tài)變化與茉莉酸含量一致。

由圖2-B可知，在未接種黃萎病菌條件下，感病材料Arcot-438根系水楊酸含量出現(xiàn)的峰值分別是在處理后1、15 d，處理后3 d含量達到最低值；在接種黃萎病菌條件下，Arcot-438根系水楊酸含量在處理1 d時開始升高，處理3 d時出現(xiàn)峰值，之后開始緩慢下降，15 d以后含量變化不再明顯。

3結(jié)論與討論

茉莉酸、水楊酸在植物防御病害過程中有重要的作用，它們參與病原菌誘導(dǎo)的抗病過程并誘發(fā)植物的系統(tǒng)抗性[11-13]。高峰等對棉花的研究發(fā)現(xiàn)，接種黃萎病菌30 min后，用2 mmol/L 水楊酸噴施棉花后發(fā)病率降低24.8%，病情指數(shù)減輕52.5%，而傷害，特別是病菌侵染會使植物體內(nèi)的茉莉酸、水楊酸含量提高[14]。Baldwin等發(fā)現(xiàn)，煙草在受傷后的90 min 內(nèi)，受傷葉片中茉莉酸含量增加了10倍，180 min后根系中茉莉酸含量增加了3.5倍[15]；Durner等對煙草的研究發(fā)現(xiàn)，接種煙草花葉病毒24～36 h后，煙草葉片中的水楊酸含量提高[16]。本研究結(jié)果表明，無論是抗病品種還是感病品種，棉花黃萎病菌的侵入都導(dǎo)致根系茉莉酸、水楊酸含量的升高：抗病材料根系的茉莉酸、水楊酸含量在處理后1 d達最高值，感病材料根系茉莉酸含量在處理后7 d達最高值，水楊酸含量在處理后3 d達最高值，這與前人研究結(jié)果一致。

茉莉酸、水楊酸的抗病信號途徑是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其含

量的動態(tài)變化受許多生物因素和非生物因素的影響[11]。在本研究中，在接種與未接種條件下，2種激素含量的動態(tài)變化存在差異，無論是抗病材料還是感病材料，在接種條件下2種激素含量最高值出現(xiàn)的時間都早于未接種條件，說明茉莉酸、水楊酸含量隨著病害程度變化而不同?？共〔牧?、感病材料對病菌侵入的敏感性不同，抗病材料中茉莉酸含量峰值出現(xiàn)的時間比感病材料早6 d左右，水楊酸含量峰值出現(xiàn)的時間比感病材料早2 d左右，說明抗病材料比感病材料可能更早地開始抑制病菌侵入?？共〔牧系能岳蛩崤c水楊酸含量在接種后1 d已經(jīng)達最大值，由于本研究未對接種后0～24 h內(nèi)的根系進行取樣分析，是否2種激素含量的最高值有可能出現(xiàn)在0～24 h內(nèi)，尚待進一步試驗證實。

參考文獻：

[1]楊華，蔡立旺，潘群斌，等. 棉花黃萎病研究進展淺述[J]. 江西棉花，2006（6）：3-6.

[2]林玲，張昕，鄧晟.棉花黃萎病研究進展[J]. 棉花學(xué)報，2014，26（3）：260-267.

[3]李亞棟，何近剛.棉花黃萎病抗性機制與抗病育種研究進展[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，15（2）：88-91.

[4]徐理，朱龍付，張獻龍.棉花抗黃萎病機制研究進展[J]. 作物學(xué)報，2012，38（9）：1553-1560.

[5]周庭輝，戴小楓. 棉花抗黃萎病生理與生化機制研究[J]. 分子植物育種，2006，4（4）：593-600.

[6]Goicoechea N，Aguirreolea J，Cenoz S，et al. Gas exchange and flowering in Verticillium-wilted pepper plants[J]. Jounal of Phytopathology，2001，149（5）：281-286.

[7]駱琰妍，李魏，戴良英.不同激素信號途徑在植物抗病中的相互作用研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29（18）：153-157.

[8]Pieterse M J，Leon-Reyes A，Ent S V D，et al. Networking by small-molecule hormones in plant immunity[J]. Nature Chemical Biology，2009，5（6）：308-316.[9]田國忠，李懷方，裘維蕃.植物激素與植物病害的相互作用[J]. 植物生理學(xué)通訊，1999，35（3）：177-184.

[10]石磊巖，孫文姬.棉花抗黃萎病苗期鑒定方法[J]. 植物保護，1987，13（1）：42.

[11]陸雯，潘璐琪，王雪艷.水楊酸及茉莉酸介導(dǎo)植物抗病性的研究進展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（10）：40-43.

[12]Alvarez M E. Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease[J]. Springer Netherlands，2000，44（3）：185-198.

[13]Vergne E，Grand X，Ballini E，et al. Preformed expression of defense is a hallmark of partial resistance to rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae[J]. BMC Plant Biology，2010，10（3）：1-17.

[14]高峰，李國英，王欽英.水楊酸誘導(dǎo)棉花耐黃萎病的效應(yīng)[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，41（5）：333-336.

[15]Baldwin I T，Zhang Z P，Diab N，et al. Quantification corrections and manipulations of wound-induced changes in jasmonic acid and nicotine in Nicotiana sylvestris[J]. Planta，1997，201（4）：397-404.

[16]Durner J，Shah J，Klessig D F. Salicylic acid and disease resistance in plants[J]. Trends Plant Science，1997，2（7）：266-274.張蕾，蔣繼志，于永昂. 拮抗細菌TD-12菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化及鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：143-146.