王堯 單一波 史宏燦 楊俊峰 范懿魏

225001揚州大學臨床醫(yī)學院胸心外科，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室，揚州大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心

3D打印氣管補片細胞相容性和生物力學性能研究

王堯 單一波 史宏燦 楊俊峰 范懿魏

225001揚州大學臨床醫(yī)學院胸心外科，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室，揚州大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心

目的 研究3D打印氣管補片的生物力學性能及其與骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的生物相容性。方法 從幼年新西蘭大白兔脛骨平臺抽取骨髓，通過全骨髓培養(yǎng)及貼壁純化法獲取BMSCs進行培養(yǎng)和傳代。對3D打印氣管補片進行生物力學測試；同時將其與BMSCs共培養(yǎng)后進行細胞形態(tài)觀察，并用磺酰羅丹明B（SRB）比色法測定細胞增殖活性。結(jié)果 3D打印氣管補片具有良好的生物力學性能；其與BMSCs共培養(yǎng)后細胞形態(tài)正常，貼壁生長良好，且SRB比色法顯示細胞增殖良好。結(jié)論 3D打印氣管補片具備良好的生物力學性能和生物相容性，是一種具有開發(fā)潛力的生物材料，可用于組織工程氣管的體外構(gòu)建。

3D打印氣管補片； 生物力學； 生物相容性； 組織工程氣管

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81170014,81370118);High-end Talent Support Program of Yangzhou University(201431);Research and Innovation Programme Fund of Colleges and Universities in Jiangsu Province(KYLX15_1388)

0 引言

氣管病變可由腫瘤、外傷、感染及先天性疾病等引起，切除病變段氣管并行端端吻合是治療的金標準。但當氣管病變長度超過成人氣管長度的1/2或小兒氣管長度的1/3時，只有植入氣管替代物才是最可行的方法[1-2]。氣管替代物的主要來源有同種異體組織、自體組織、生物材料及組織工程假體；然而，大量動物實驗結(jié)果顯示，由于移植后替代物不能形成有效的上皮化和血管化及出現(xiàn)感染、壞死、管腔堵塞等情況，結(jié)果導致移植失敗[3]。3D打印技術(shù)的發(fā)展為解決氣管替代物的再上皮化和再血管化問題提供了新思路。

Schantz等[4]以聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）為原料，利用溶融沉積成型（fused deposition modeling，F(xiàn)DM）技術(shù)制備了骨軟骨復合支架，并將成骨細胞與軟骨細胞分別種植于支架的兩部分。數(shù)周后在成骨細胞種植區(qū)測出較高的骨鈣，而軟骨細胞種植區(qū)測出了較高的堿性磷酸酶，表明該支架有望用于骨軟骨修復方面。Chang等[5]以新西蘭兔為實驗對象，將兔的氣管開1 cm×1 cm的窗口，然后用種植骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的3D PCL補片修補氣管缺口。術(shù)后第4周和第8周，經(jīng)CT、纖維支氣管鏡和組織學分析等檢查發(fā)現(xiàn)，重建的氣管形狀和功能正常，未出現(xiàn)任何的免疫排斥反應。本研究旨在以PCL為材料，通過3D打印技術(shù)打印出氣管補片并研究其細胞相容性和生物力學性能，從而尋求合適的組織工程氣管支架材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

實驗動物購自揚州大學醫(yī)學院實驗動物中心，健康3周齡清潔級新西蘭兔1只，雌性，體質(zhì)量為1.5 kg，用來抽取BMSCs；健康4周齡清潔級新西蘭兔6只，體質(zhì)量為2.5～3.0 kg，雌雄不限，用于生物力學測試。

聚全氟乙丙烯、聚氯乙烯（無錫美生醫(yī)療器械有限公司），DMEM-F12培養(yǎng)基（美國HyClone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B溶液（生工生物工程（上海）股份有限公司），吲哚美辛、地塞米松、黃嘌呤、胰島素、磺酰羅丹明B（sulforhodamine B,SRB）、三氯醋酸（美國Sigma-Aldrich公司），膠原蛋白（康寧生命科學（吳江）有限公司），鼠抗兔抗CD44-PE、CD34-PE（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

超凈工作臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司），CKX41倒置光學顯微鏡（日本Nikon公司），RS232恒溫培養(yǎng)箱、Labofuge 400R離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），S4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司），3367萬能拉伸試驗機（美國Instron公司），Epoch酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的獲取與培養(yǎng)

抽取鹽酸賽拉嗪注射液2 ml麻醉新西蘭大白兔，固定、備皮、消毒、鋪單。用18號骨髓穿刺針于左右脛骨平臺處進行穿刺，然后用含有肝素的5 ml注射器抽取骨髓約2 ml。在潔凈工作臺中，將骨髓和肝素鈉的混合液移入15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加PBS混勻后再1 000 r/min離心5 min，棄上清；加含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基5 ml進行重懸，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。此后，每隔48小時進行換液至傳代，并通過貼壁篩選法去除未貼壁的細胞。待培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞生長接近80%融合時，進行傳代。棄上清，PBS沖洗2次，滴加質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰酶1 ml，2 min后鏡下見細胞回縮變圓，立即加入培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻；500 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮的含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DEME-F12培養(yǎng)基重懸細胞，以1∶2比例傳代至培養(yǎng)皿中。之后每隔48小時進行換液并觀察細胞生長情況，直至培養(yǎng)皿中細胞達80%融合后進行傳代。將經(jīng)過滅菌的玻片置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，取第3代細胞懸液用吸管滴加幾滴于玻片上，蓋好后置于恒溫箱中孵育12 h后取出玻片進行免疫熒光鑒定。

1.2.2 BMSCs的鑒定

（一）免疫熒光檢測

將已制好的細胞爬片，用質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定90 min，PBS沖洗3次，2 min/次；再加入體積分數(shù)為0.5%的曲拉通X-100（TritonX-100）37℃孵育20 min，PBS沖洗2次，5 min/次；然后滴加質(zhì)量濃度為10 g/L的牛血清白蛋白37℃孵育30 min，除去多余液體；直接滴加含熒光素的鼠抗兔抗體（抗CD34-PE、抗CD44-PE），4℃過夜，PBS沖洗2次，2 min/次，最后留少量PBS觀片。

（二）成脂誘導

將第3代BMSCs接種到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%融合后，改用成脂細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每2天進行換液；10 d后將細胞用PBS沖洗3次，5 min/次，用質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定5 min，PBS沖洗3次；加油紅O染色5 min，蒸餾水沖洗后于倒置光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 3D打印氣管補片的制備

3D打印氣管補片由河南鄭州創(chuàng)世紀3D打印公司制作。具體過程如下：通過建模軟件犀牛5.0畫出尺寸為10 mm×10 mm的三維實體框，導出stl格式文件；再將stl格式的三維數(shù)據(jù)文件導入打印機切片軟件Cura 15.02.1，設(shè)置層厚為0.15 mm，填充65%，壁厚為0.8 mm，打印機噴頭溫度為120℃。打印總時長約50 min。

1.2.4 掃描電鏡觀察

將3D打印氣管補片噴金后用掃描電鏡觀察分析。

1.2.5 3D打印氣管補片的生物相容性檢測

（一）細胞形態(tài)觀察

設(shè)空白對照組、聚全氟乙丙烯組（陰性對照組）、3D打印氣管補片組（實驗組）和聚氯乙烯組（陽性對照組），每組設(shè)5個平行樣本。將受試材料置于培養(yǎng)皿中，加入1ml濃度為1.0×105/ml的第3代BMSCs懸液，再加入1 ml新鮮培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中定時通過倒置顯微鏡觀察受試材料表面及邊緣細胞的形態(tài)及生長狀態(tài)，并根據(jù)表1進行毒性分級。（二）SRB比色法

表1 細胞形態(tài)與毒性分級標準

設(shè)空白對照組、聚全氟乙丙烯組（陰性對照組）、3D打印氣管補片組（實驗組）和聚氯乙烯組（陽性對照組）。按浸漬介質(zhì)體積∶試樣表面積為10 ml∶1 cm2制備樣本浸漬液，浸漬介質(zhì)為含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中培育24 h后滅菌備用。取96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl濃度為1.0×105/ml的BMSCs懸液進行培養(yǎng)；24 h后，每孔加入100 μl樣本浸漬液，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、3、5、7、9 d；吸棄上清液，每孔加入100 μl體積分數(shù)為10%的三氯醋酸，置于4℃冰箱1 h，自來水沖洗5次，自然晾干；每孔加入40 μl質(zhì)量分數(shù)為0.4%的SRB，放于培養(yǎng)箱中30 min后，用體積分數(shù)為1%的醋酸漂洗4次，自然晾干；每孔加150 μl 10 mmol/L、pH 10.5的Tris堿，震蕩20 min使紫色物充分溶解；最后采用酶標儀測定570 nm處各孔的吸光度（OD）值，并以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.6 生物力學測試

用游標卡尺測量各樣本的長度、厚度及寬度。用萬能拉伸試驗機測試各樣本的基質(zhì)張力性能：將樣本固定于萬能拉伸試驗機，給予1 N的初始負荷，室溫下以30 mm/min的恒定速率開始檢測，實時記錄組織負荷及伸長率，判斷樣本最大力、彈性模量及組織變形情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示，兩組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)與傳代

由圖1可知，培養(yǎng)48h后BMSCs貼壁，成簇生長，形態(tài)不一，多呈梭形（圖1A）；6 d后BMSCs集落形成，細胞形態(tài)多呈梭形、多角形（圖1B）；8d后BMSCs單層形成，融合達80%（圖1C）；同時，第3代BMSCs中扁平細胞數(shù)量所占比例有所增加（圖1D）。

2.2 BMSCs的鑒定

2.2.1 成脂誘導

成脂誘導實驗結(jié)果如圖2所示，成脂誘導10 d后細胞體積明顯增大，油紅O染色成鮮紅色（圖2A中箭頭所示）；而陰性對照組油紅O染色則未顯示鮮紅色（圖2B）。

2.2.2 細胞免疫熒光

圖4 3D打印氣管補片的結(jié)構(gòu)觀察

細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，標記CD44-PE的第3代BMSCs呈現(xiàn)出的綠色熒光遍及整個細胞表面（圖3A）；而標記CD34-PE的第3代BMSCs呈棕褐色，無綠色熒光（圖3B）。提示該細胞CD44抗原表達陽性，CD34抗原表達陰性。

2.3 3D打印氣管補片的結(jié)構(gòu)觀察

3D打印氣管補片的宏觀結(jié)構(gòu)如圖4A所示；圖4B、4C為3D打印氣管補片超微結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖，表明3D打印氣管補片擁有適宜的孔隙率，其孔徑為300～500μm。

2.4 生物力學性能測試

由表2可知，3D打印氣管補片的最大應力及彈性模量明顯優(yōu)于原生氣管補片，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而兩種氣管補片的長度、寬度和厚度間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 3D打印氣管補片的體外生物相容性檢測

2.5.1 細胞形態(tài)觀察

3D打印氣管補片組的BMSCs形態(tài)在1～7 d均正常，細胞貼壁生長良好，與聚全氟乙丙烯組無明顯差異；而聚氧乙烯組中大量細胞死亡，細胞變大變圓，其內(nèi)可見許多空泡，胞核固縮，基本不貼壁生長。（圖5）

2.5.2 SRB比色結(jié)果

如圖6所示，3D打印氣管補片組與空白對照組、聚全氟乙丙烯組的細胞增殖曲線很接近，1～7 d呈不斷上升趨勢，7 d后由于細胞自身衰老死亡開始呈下降趨勢，3組相同時間點OD值間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而聚氯乙烯組的細胞增殖曲線隨著時間延長呈下降趨勢，到7 d左右細胞已基本死亡，與3D打印氣管補片組相同時間點（1 d除外）的OD值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 原生氣管補片與3D打印氣管補片形態(tài)學與機械性能指標（±s，n=6）

表2 原生氣管補片與3D打印氣管補片形態(tài)學與機械性能指標（±s，n=6）

注：與原生氣管補片比較，aP＜0.05

機械性能指標長度（mm） 寬度（mm） 厚度（mm） 最大應力（N） 彈性模量（MPa）原生氣管補片 50.23±0.31 11.50±0.46 0.83±0.06 6.46±0.92 1.62±0.13 3D打印氣管補片 50.33±0.19 11.70±0.17 1.13±0.04 58.16±2.78a 93.27±7.83a樣品 形態(tài)學指標

圖6 細胞增殖曲線

3 討論與結(jié)論

3D打印技術(shù)[6]是指采用三維噴墨打印技術(shù)，通過分層加工與疊加成形相結(jié)合的方法，逐層打印增加材料來生成3D實體，達到與激光成型等其他3D模型制造技術(shù)相同的3D真實物體的數(shù)字制造技術(shù)。與傳統(tǒng)的組織工程學相比，3D打印技術(shù)[7]具有精度高、構(gòu)建速度快、可按需制造以滿足個體化醫(yī)學治療的需求、排斥反應低等優(yōu)勢。因此，通過3D打印技術(shù)制備氣管補片是可行的。理想的生物支架應具有良好的生物相容性，能以合適的速度自然降解和吸收，還能為種植細胞提供誘導分化的微環(huán)境[8]。PCL[9]有著較好的生物兼容性、出色的機械強度和耐久性，且熱塑性良好、易加工成型、熔點低，使得PCL被廣泛應用于生物組織工程領(lǐng)域。

3D打印技術(shù)是近年來發(fā)展的新興技術(shù)，通過該技術(shù)打印出來的氣管補片是否具有出色的機械性能及生物相容性，需要通過實驗來檢驗。組織工程氣管支架材料必須具有一定強度的機械性能。因此，可通過對3D打印氣管補片進行生物力學測試，以合理、準確地評估其生物力學性能，從而實現(xiàn)組織工程氣管力學性能的可預測性。實驗結(jié)果顯示，3D打印氣管補片的機械性能明顯優(yōu)于原生氣管補片，完全達到組織工程氣管支架材料的要求。

所有的生物材料都必須通過實驗檢測其是否具有細胞毒性[10]，而將其與體外細胞共培養(yǎng)是最常用、最快速及最靈敏的方法[11]。細胞在材料上的黏附是細胞進一步生長和分化的基礎(chǔ)，也是衡量材料生物相容性的重要指標[12]。當細胞接觸到有毒生物材料時，其形態(tài)或增殖狀態(tài)會發(fā)生改變，還可觀察細胞在材料表面的黏附生長情況，這些都為評估生物材料的生物相容性提供了可靠依據(jù)。本研究將3D打印氣管補片與BMSCs共培養(yǎng)后，通過觀察細胞形態(tài)及SRB比色法來評估生物材料的生物相容性。結(jié)果顯示，3D打印氣管補片組細胞形態(tài)在1～7 d均正常，細胞貼壁生長良好，與空白對照組及聚全氟乙丙烯組無明顯差異；而聚氯乙烯組中大量細胞死亡，細胞變大變圓，其內(nèi)可見許多空泡，胞核固縮，基本不貼壁生長。同時，SRB比色法結(jié)果表明，3D打印氣管補片組的BMSCs增殖曲線與空白對照組及聚全氟乙丙烯組基本一致，隨著時間延長呈不斷上升趨勢；而聚氯乙烯組的細胞增殖曲線則隨著時間延長呈下降趨勢，到7 d左右細胞已基本死亡。充分證實了3D打印氣管補片無細胞毒性，具有良好的細胞生物相容性。

本研究通過對3D打印氣管補片生物力學性能和生物相容性的研究，證實了3D打印氣管補片具有較強的機械性能和良好的生物相容性，是一種具有開發(fā)利用潛力的生物材料；同時，也為下一步的動物體內(nèi)實驗提供了實驗依據(jù)。

利益沖突 無

（圖1、2見插頁4-5，圖3、5見插頁4-6）

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Cellular biocompatibility and biomechanical properties of 3D printed tracheal graft

Wang Yao,Shan Yibo, Shi Hongcan,Yang Junfeng,Fan Yiwei

Department of Cardiothoracic Surgery,Medical College of Yangzhou University;Key Laboratory of Integrative Medicine in Geriatrics Control of Jiangsu Province;Center of Translational Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225001,China

Shi Hongcan,Email:shihongcan@hotmail.com

Objective To prepare 3D printed tracheal graft and investigate its cellular biocompatibility and biomechanical properties.Methods Bone marrow was isolated from tibial plateau of young New Zealand white rabbit,and bone mesenchymal stem cells(BMSCs)were obtained by whole bone marrow culture method and adherent purification method.Biomechanical test was performed for 3D printed trachea graft.After co-cultured of 3D printed trachea graft and BMSCs,cell morphology was observed and the proliferation index of the cells on 3D printed trachea graft was quantified using sulforhodamine B(SRB)assay.Results 3D printed trachea graft showed excellent biomechanical properties.Cell morphology was normal and cells grew well after co-culture with 3D printed trachea graft.The SRB assay indicated good proliferation of BMSCs on 3D printed trachea graft.Conclusions 3D printed trachea graft shows favorable cellular biocompatibility and biomechanical properties,and therefore can be used as a scaffold material for tissue-engineered trachea.

3D printed trachea graft;Biomechanical properties;Cellular biocompatibility; Tissueengineered trachea

史宏燦，Email:shihongcan@hotmail.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．002

國家自然科學基金（81170014，81370118）；揚州大學“高端人才支持計劃”資助項目（201431）；江蘇省2015年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃基金（KYLX15_1388）

2016-05-22）