脂肪氧合酶高效制備關(guān)鍵技術(shù)研究

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）屬于氧化還原酶，是一類含有非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，能夠?qū)Ｒ淮呋趸衂，Z-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物的雙加氧酶，可作為面粉增白劑和增香劑、抗腫瘤藥物前體、涂料與洗滌劑等生產(chǎn)原料，具有巨大的市場(chǎng)需求。由于商品化的LOX主要通過大豆浸提獲得，受大豆來(lái)源的影響，產(chǎn)品批次間的性質(zhì)差異較大，不利于下游產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。

近年來(lái)，隨著LOX應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家等通過分子改造、高產(chǎn)菌構(gòu)建及發(fā)酵過程優(yōu)化的研究，以獲得應(yīng)用性能優(yōu)良的LOX并實(shí)現(xiàn)其高效生產(chǎn)。Cristea，M（2005）研究在畢赤酵母中表達(dá)含錳的脂肪氧合酶和推定金屬配體的定點(diǎn)突變；Bae，JH（2010）從銅綠假單胞菌PR3中發(fā)現(xiàn)了一種新的熱穩(wěn)定的LOX。其被純化了34.3倍，復(fù)得率為5.14%，純化后酶的Km和Vmax值分別為3 57 mmol/L和0 73 mu mol/min//mg。María等（2012）克隆了西蘭花基因組中的脂肪氧合酶（BoLOX1）基因，序列分析顯示BoLOX1和其他高等植物脂肪氧合酶相似，并分析了該基因的表達(dá)，結(jié)果表明BoLOX1在植物采后衰老過程中有較大提高。 María等（2012）克 隆 了 橄 欖 脂 肪 氧 合 酶c DNA（Oep2LOX1），并對(duì)光照、溫度、損傷對(duì)脂肪氧合酶在橄欖果表皮中的表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。國(guó)內(nèi)的江南大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)等在脂肪氧合酶高效制備技術(shù)上進(jìn)行了深入的研究。如：CN201310287699.X公開了一種熱穩(wěn)定脂肪氧合酶突變體及其構(gòu)建方法，通過PCR法分別對(duì)脂肪氧合酶的蓋子結(jié)構(gòu)201-TQRGQG-206進(jìn)行G204P、G206P、G204P/G206P 及L6loop→PT linker突變，并得到具有熱穩(wěn)定性的脂肪氧合酶。與野生酶相比，脂肪氧合酶突變體在50℃下的半衰期及最適反應(yīng)溫度均有顯著提高，改造后的酶更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。CN201210578451.4公開了一種酶活性及熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶，是在GenBank PA119公布的基因序列編碼的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上，其N端氨基酸缺失，其中缺失尤以缺失30個(gè)為佳。使用該方法得到的新型脂肪氧合酶，酶學(xué)性質(zhì)較好的突變株，熱穩(wěn)定性提高2.1倍，比酶活仍能維持初始的90%。陸信曜（2013）將來(lái)源于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的LOX基因在大腸桿菌（Escherichia coli）Rosetta（DE3）中進(jìn)行分泌表達(dá)，并對(duì)重組酶進(jìn)行了性質(zhì)分析和熱穩(wěn)定性改造。其通過分段缺失重組LOX N端高柔性區(qū)域，在未影響催化效率的前提下提高了酶的熱穩(wěn)定性；通過突變、替換和缺失等策略降低“蓋子”結(jié)構(gòu)鉸鏈loop的柔性，以提高LOX熱穩(wěn)定性；通過N末端融合表達(dá)自組裝雙親短肽（SAP）提高LOX熱穩(wěn)定性和催化效率。陸信曜（2013）以研究室保存的脂肪氧合酶生產(chǎn)菌株重組大腸桿菌Rosetta（DE3）/pre-LOX為研究對(duì)象，在搖瓶水平上對(duì)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、外源添加物進(jìn)行優(yōu)化；在3L發(fā)酵罐水平上對(duì)初始誘導(dǎo)菌體濃度（OD600）進(jìn)行優(yōu)化。搖瓶發(fā)酵條件下，誘導(dǎo)溫度為20℃，當(dāng)菌體OD600達(dá)到0.6，添加1 mmol/L誘導(dǎo)劑及0.5%吐溫-20，胞外酶活達(dá)到8.4 U/mL；在3 L發(fā)酵罐上，誘導(dǎo)溫度為20℃，當(dāng)菌體OD600達(dá)到8.0，添加1 mmol/L誘導(dǎo)劑及0.5%十二烷基磺酸鈉，胞外酶活為8.3 U/mL。章棟梁（2012）采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法，對(duì)影響重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪氧合酶的7個(gè)相關(guān)因子進(jìn)行篩選，并建立枯草芽孢桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶的最佳工藝。結(jié)果表明對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著影響的因子是乳糖、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度。刁含文（2015）研究了重組魚腥藻脂肪氧合酶定點(diǎn)突變及突變酶酶學(xué)性質(zhì)，重組魚腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）基因來(lái)自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定點(diǎn)突變技術(shù)將Ana-LOX的421位和40位的纈氨酸（Val）突變?yōu)楸彼幔ˋla），獲得突變體V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期為3.8 min。而突變酶V421A和V40A在50℃的半衰期分別為4.4 min和7.0 min。突變酶V421A/V40A的半衰期為8.3 min，與野生型Ana-LOX相比，提高了1.18倍。相對(duì)于野生酶，突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分別提高了4.83%、41.58%、80.07%。突變酶的最適反應(yīng)溫度均比野生酶（35℃）高5℃。CN201410053650.2公開了一種酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體及制備方法，利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)魚腥藻脂肪氧合酶分子進(jìn)行定向改造，經(jīng)多輪易錯(cuò)PCR和DNAShuffling，獲得了酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體，酶活力為21 420 U/mL，比野生型提高了2.17倍。

隨著應(yīng)用研究的深入，LOX在食品加工、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景。在此背景下，如何獲得具有良好應(yīng)用性能的LOX并實(shí)現(xiàn)其高效發(fā)酵生產(chǎn)，將成為國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的重要方向。

（江南大學(xué)圖書館張群）