劉秀花， 孔冠楠， 王莉， 宋兆齊，梁峰

(商丘師范學院 生物精煉河南省工程實驗室，河南 商丘， 476000)

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木糖對產油假絲酵母油脂積累的影響

劉秀花， 孔冠楠， 王莉， 宋兆齊，梁峰

(商丘師范學院 生物精煉河南省工程實驗室，河南 商丘， 476000)

摘要：微生物利用纖維質材料生產生物燃料具有重要的意義.本實驗對實驗室分離、篩選的一株產油假絲酵母進行了油脂積累隨時間變化的觀察及木糖對菌體油脂積累影響研究.結果表明以40 g/L的葡萄糖為碳源時，假絲酵母細胞內油脂隨時間變化先增加后減少；用不同濃度木糖代替葡萄糖，葡萄糖與木糖不同比例時碳源消耗均較大，而生物量則在碳源全為木糖時相對較少，細胞含油率在純木糖時卻最高，達到43.5%.因此木糖為碳源有利于假絲酵母油脂積累，可用此菌進行玉米芯降解液的發(fā)酵.

關鍵詞：假絲酵母；木糖；糖消耗；生物量；油脂百分率

人類社會面臨化石能源枯竭、溫室氣體嚴重超標、環(huán)境污染嚴重等全球問題，新能源的開發(fā)是解決目前嚴重問題的最理想的方法，綠色能源近年來生物領域的研究發(fā)展迅速，尤其是發(fā)現(xiàn)一些藻類、霉菌、酵母菌、細菌均存在產油菌種，粘紅酵母屬產油菌株中油脂含量最高的,能達到72%[1]，將生成的油脂轉換成生物柴油不僅有助于緩解能源問題，而且無污染；微生物油脂多是中性脂，并且微生物菌體如霉菌、酵母菌等有發(fā)酵周期短，易大批量生產，并可利用秸稈酸解液[2]進行廢物利用，實現(xiàn)能源再生而成為研究熱點.本實驗研究假絲酵母利用葡萄糖積累油脂過程觀察，并探究假絲酵母利用木糖積累油脂的特征.

1材料與方法

1.1研究材料

供試菌種菌種，假絲酵母菌B(CandidaalbicanB).PDA培養(yǎng)基用于菌種活化和保存.GMY液體培養(yǎng)基，每升含磷酸二氫鉀8 g， 七水合硫酸鎂0.5 g， 酵母膏3 g，單糖40 g(葡萄糖或/和木糖)，pH5.5.

1.2研究方法

1.2.1蘇丹黑染色法與菌體內油脂觀察

每24 h取出1 mL菌液于1.5 mL離心管進行離心后加入0.5 mL蘇丹黑染液，混合均勻后靜置染色1 h，離心去染液，加水清洗，加70%酒精清洗一次，再加水清洗離心后用無菌水懸浮，進行水裝片觀察[3].

1.2.2還原糖含量測定

還原糖含量采用DNS法[4].

1.2.3菌體生物量測定

將發(fā)酵完成的菌液4000 r/min離心5 min，收獲菌體，并無菌水洗3次，放入-20℃冷凍2 h，在冷凍干燥機中凍干24 h，取出用已恒重的稱量瓶稱重.

1.2.4油脂提取、油脂含量測定

提取油脂采用熱酸解法[5].含量測定采用質量分析法，將提取的油脂用石油醚和乙醚轉移到小燒杯中，在105℃烘干箱中烘干2 h，放入干燥器中0.5 h后用分析天平稱重，反復幾次直到差值不超過0.01 g，利用燒杯裝油前后差值計算油重.

1.2.6菌體培養(yǎng)

用250 mL三角瓶分裝GMY液體培養(yǎng)基100 mL，經(jīng)滅菌后接種，24 h種子培養(yǎng)后，再以10的接種量轉接新鮮培養(yǎng)基內，28 ℃，180 rpm條件下培養(yǎng)，不同時間點取菌體進行顯微觀察優(yōu)質積累情況，并收獲菌體用于生物量分析和憂患量分析.

2結果與分析

2.1菌體內油脂積累過程及發(fā)酵液中殘?zhí)橇孔兓?/p>

為了研究假絲酵母B利用葡萄糖積累油脂情況，從液體培養(yǎng)第1 d開始，采取蘇丹黑染色法觀察菌體油質積累情況，同時采用DNS法測定殘?zhí)?，來跟蹤觀察油脂積累過程和殘?zhí)亲兓P系.如圖1所示，深藍色的部分是被蘇丹黑染色的油脂，由圖1可知菌體可呈現(xiàn)假絲狀，芽殖.

圖1　酵母菌體內油脂顯微圖片F(xiàn)igure 1　the micrographs of lipid body in yeast cells (A～H：1～8day)

從圖1A到圖1C可以看出，菌體由細長到個別體積變大，再到多個細胞體積變大；油脂從小塊兒到幾乎充滿菌體，是一個菌體和油脂的生長過程.從圖1D到圖1F可以看出多數(shù)菌體被油脂幾乎充滿，油脂累積處在高峰.從圖1G到圖1H可以看出，膨大的菌體內部被染色的油脂顏色淡化，甚至消失，油脂被利用.

每天檢測發(fā)酵液中殘?zhí)橇?，其變化如圖2所示.由圖2可知每升培養(yǎng)液中由最初的40 g，隨培養(yǎng)時間的增加逐漸減少，培養(yǎng)到第3、4 d時，糖消耗近一半，到第7、第8否d近乎消耗完全.由圖1和圖2顯示結果可知，綜合菌體內油脂積累變化和發(fā)酵液中糖消耗量變化.在限氮基礎培養(yǎng)基上，在菌株開始培養(yǎng)時油脂即開始積累，并隨著碳源的消耗，在培養(yǎng)第3 d，碳源消耗近半時，菌體體積變大，油脂持續(xù)生長近乎充滿菌體，在培養(yǎng)到5、6 d時，多數(shù)菌體體積增加，油脂近乎充滿菌體，糖穩(wěn)步消耗，油脂積累處在高峰期；最后在培養(yǎng)7、8 d時碳源消耗殆盡，菌體內油脂染色顏色開始變淺，菌體在培養(yǎng)基中糖不足時開始消耗體內積累脂類.

2.2木糖對假絲酵母積累油脂的影響

基于對玉米芯降解液進行發(fā)酵生產生物柴油的目的，用玉米芯降解物木糖作為碳源探究假絲酵母利用木糖對油脂積累的影響；設計實驗是在限氮基礎培養(yǎng)基上，碳源是葡萄糖與木糖比例為1∶0、1∶1、0∶1三組，考慮到生產周期不宜過長，以及節(jié)約經(jīng)濟成本，則每組均從第3 d開始收獲菌體并提油直到第7 d為止研究殘?zhí)橇?、生物量及含油百分率的變化情況.

2.2.1不同木糖比殘?zhí)橇侩S時間變化

基于此假絲酵母為工程菌，存在木糖代謝途徑，即假絲酵母利用碳源轉化為油脂，因此每天對發(fā)酵液中殘?zhí)橇窟M行測定，結果如圖3所示，在每組糖比例下，隨時間增長，各組糖含量均在減少，減少趨勢一致，消耗程度相當，即在總糖為40 g/L時，到第7 d時均消耗近半，說明此株酵母菌可同時利用木糖與葡萄糖用于生長代謝.

圖2　殘?zhí)橇侩S時間變化　　　　　　　　 圖3 不同比例葡萄糖和木糖培養(yǎng)條件下殘?zhí)橇侩S時間變化　　　　　　Figure 2 Residual sugar changes over time 　　　　　　　　　　 Figure 3　The change of sugar consumption over time

2.2.2不同木糖比例下對生物量的影響

假絲酵母利用葡萄糖和木糖生長繁殖，隨著培養(yǎng)時間的增加，碳源不斷消耗，菌體不斷增多，生物量形成情況如圖4所示，當碳源全為葡萄糖時，每天收獲生物量均較多，葡萄糖∶木糖為1∶1時次之，當為全木糖時，收獲生物量有明顯差異，即最少.有圖4顯示，假絲酵母利用以上三組不同糖比例時，糖消耗不存在顯著性差異，因此假絲酵母利用糖類除用于生長外，更多的用于其他代謝.

經(jīng)F檢驗，三組不同糖比例下生物量收獲從第3 d開始到第7 d，其中前兩組是第4、5 d不存在顯著性差異，但較第3 d有顯著性差異；第6、7 d不存在顯著性差異，但較第4、5 d有顯著性差異；而第三組是，第3、4、5 d不存在顯著性差異，第6、7 d亦不存在顯著性差異，但第6、7 d較前3 d有顯著性差異.說明葡萄糖存在時在前期生長有助于菌體快速增殖，而全木糖時，菌體增殖較慢.

2.2.3不同糖比例對細胞含油量影響

由于菌體利用營養(yǎng)物質除生長外，大部分碳源用于積累油脂，在不同木糖比例下，油脂積累情況如圖5所示，由圖5可知，油脂百分含量在三組糖比例中從1∶0到1∶1到0∶1呈現(xiàn)增長趨勢，即當全為木糖時，每天相比較含油百分比均較高，在三組中油脂積累最好的時間第6 d時，全木糖的高達43.5%.另外，在前兩組中第3、4 d含油百分比均較低，并不存在顯著性差異，第5、6、7 d含油百分比達到高峰期，與前兩天相比有顯著性差異；而在第三組中第3 d含油百分比較低，從第4 d開始油脂積累較多，即第4、5、6、7 d較第3 d有顯著性差異，且第6 d為最佳油脂積累時期，此時由圖3、4可以看出糖消耗近半，生物量為5.6 g/L.

圖4　三種條件下生物量隨時間變化　　　　　　　　圖5　不同糖比例菌體油脂百分率隨時間變化Figure.4 The change of biomass over time in different 　　　　　　　Figure.5 The change of oil percentage of yeast over time in different 　　　　　　　proportion of sugar　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　proportion of sugar

3結論

此假絲酵母B油脂積累從對數(shù)生長期開始，在穩(wěn)定期油脂積累一直處于上升狀態(tài)，油脂在較長一段時期處于積累高峰期，菌體可利用性強，實驗室其它實驗驗證在發(fā)酵條件是180 rpm，28 ℃，250 mL三角瓶中裝液量50 mL，接種量10%，可使油脂積累達到50%；油脂產量達4.74 g/L；在用不同濃度木糖替代葡萄糖時，菌體仍生長良好，但卻積累油脂百分比更高，并在最佳培養(yǎng)天數(shù)6 d時，油脂百分比高達43.5%.這在微生物能源方面有較好的發(fā)展前景，如利用一些農作物秸稈，食物殘渣等一些難利用的生物質，經(jīng)處理制成發(fā)酵液供給此菌體或其它一些真菌發(fā)酵產生油脂，并通過轉酯反應生成柴油，可以緩解能源問題.

參考文獻：

[1]Ratledge C, Wynn JP.The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms[J].Adv Appl Microbiol, 2002, 51: 1-51.

[2]方祥年,黃煒，夏黎明.假絲酵母發(fā)酵玉米芯半纖維素水解液生產木糖醇[J].生物工程學報，2004， 20(2):42-45.

[3]梁峰,王莉,夏保密,等.不同葡萄糖濃度對霉菌產有能力的影響[J].河南科技，2015,252(4):131-134.

[4]張龍翔.生化試驗方法和技術[M].北京：人民教育出版社,1980:68-90.

[5]Bligh EG, Dyer WJ.A rapid method for total lipidextraction and purification[J].Can J Biochem Physiol, 1959, 37: 911-917.

[責任編輯：徐明忠]

Xylose impact on oil Candida lipid accumulation

LIU Xiuhua，KONG Guannan，WANG Li,SONG Zhaoqi,LIANG Feng

(Biorefinery Engineering Lab of Hena Province, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

Abstract:Microorganism use of cellulosic materials to produce biofuels has the vital significance.This experiment in laboratory, screening of strain isolated oil Candida for lipid accumulation of observation over time and xylose research effects on bacteria lipid accumulation.The results showed that 40 g/L glucose as carbon source, Candida yeast cells grease increase first and then decrease along with time variation; With different concentration of xylose do carbon source instead of glucose, glucose and xylose consumption were all bigger, and the biomass in carbon source for xylose is relatively small, all lipid percentage of cells in pure xylose was the highest, up to 43.5%.Therefore xylose do carbon source benefits Candida lipid accumulation, the bacteria for corncob degradation liquid fermentation are available.

Key words:Candida;xylose;sugar consumption;biomass;kipid percentage

中圖分類號：O657.7

文獻標識碼：A

文章編號：1672-3600(2016)03-0048-04

作者簡介:劉秀花(1963-)，女，河南新鄉(xiāng)人，商丘師范學院教授，主要從事微生物資源、酶制劑、生物能源方面的研究.

基金項目：河南省重點科技攻關資助項目(No.132102310039、142102310044)

收稿日期：2015-12-23