唐夢晨　陳嬌　徐文杰　李凌

[摘要] 目的 研究銀杏葉提取物（EGB）對睡眠剝奪小鼠學習記憶能力的影響及其機制。 方法 選取成年健康清潔級小鼠48只，雌雄各半，根據隨機數字表法將小鼠隨機分為4組（n=12）：空白組，對照組，治療Ⅰ組，治療Ⅱ組，適應性飼養(yǎng)3天，每組篩選出9只進行造模。應用72 h睡眠剝奪法制作動物模型，用Y迷宮成績（正確反應次數）評定學習記憶能力，免疫組織化學法反映小鼠海馬腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）的蛋白表達。 結果 Y迷宮測試結果顯示，給藥后，對照組與治療Ⅰ組、對照組與治療Ⅱ組的正確反應次數差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組給藥前后的正確反應次數差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余3組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與對照組比較，空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組海馬區(qū)的BDNF表達增高，其灰度值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組各組間的灰度值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結論 睡眠剝奪能造成腦損傷、學習記憶能力減退以及BDNF表達減少，EGB可能是通過上調BDNF蛋白及其相關通路蛋白改善睡眠剝小鼠的學習記憶能力。

[關鍵詞] 銀杏葉提取物；睡眠剝奪；腦源性神經營養(yǎng)因子；學習記憶

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To study the influence extract of Ginkgo biloba （EGB） on learning and memory ability in sleep-deprivation mice and its mechanism. Methods Forty-eight healthy and clean adult mice were selected，half male and half female，and they were evenly divided into 4 groups according to the random number table method：blank group，control group，treatment groupⅠ， and treatment group Ⅱ，and they were given adaptive feeding for 3 days，9 mice were selected in each group to make model.72-hour of sleep-deprivation method model was applied.The learning and memory ability was evaluated by achievement of Y maze.The protein expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampal area in mice was reflected by immunohistochemistry. Results Test result of Y maze showed that，after administration，there was a statistical difference of right reaction times between control group and treatment groupⅠ，and between control group and treatment groupⅡ （P<0.05）；there was a statistical difference of right reaction times before and after administration in control group （P<0.05），the other three groups had no statistical difference （P>0.05）.Compared with control group，BDNF expression of hippocampal area in blank group，treatment group Ⅰ，and treatment group Ⅱ was improved，and there was a statistical difference of gray value （P<0.05），however，there was no statistical difference of gray value among all groups （blank group，treatment group Ⅰ，and treatment group Ⅱ） （P>0.05）. Conclusion Sleep-derivation can lead to cerebral damage，decreased learning and memory ability，and reduction of BDNF expression，and EGB may improve learning and memory in sleep-deprivation mice by up-regulating BDNF protein and its related pathway protein.

[Key words] Extract of Ginkgo biloba；Sleep-deprivation；Brain-derived neurotrophic factor；Learning and memory

睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）一般指在24 h中的睡眠<4 h，可以引起生理，心理甚至行為的變化[1]。機體處于正常睡眠狀態(tài)下，腦內某些蛋白增加，對新突觸的建立及學習記憶有很大的促進作用[2]。有研究[3]表明，中長期SD大鼠前額葉皮質腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）免疫陽性物質表達顯著減少，可造成腦損傷，影響學習記憶能力。研究[4]表明，BDNF直接參與學習的可塑性，是管理和存儲記憶的動力學因素，可能是調控學習和記憶的一個重要分子標志物。在成年中樞系統(tǒng)，BDNF的表達受很多因素的調節(jié)，同時通過調節(jié)突觸的可塑性影響學習記憶[5]。大量研究[6]表明，在正常腦中生理劑量的BDNF對學習記憶有促進作用。

銀杏葉提取物（extract of Ginkgo biloba，EGB）已被國內外用于改善腦功能不全患者的學習記憶能力， 是一種 “認知增強劑”[7]。 據報道[8]，EGB具有提高內源性BDNF表達水平的作用，作用機制有待進一步研究。那么，EGB能否改善SD小鼠的學習記憶能力，目前尚無報道。

本研究擬采用行為學、免疫組織化學法等，一方面研究EGB對SD小鼠學習記憶能力的影響，另一方面研究EGB對SD小鼠海馬BDNF的影響，進而揭示其可能的作用機制，為尋找能改善SD對學習記憶能力影響的方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取成年健康清潔級小鼠48只，雌雄各半，體質量為（23±2）g，由徐州醫(yī)學院動物中心提供。飼養(yǎng)于相對濕度在30%～40%的動物房，光照節(jié)律為12L∶12D（8：00～20：00），溫度為（25±1）℃。根據隨機數字表法將小鼠隨機分為4組，每組12只，分別為空白組，對照組，治療Ⅰ組，治療Ⅱ組。適應性飼養(yǎng)3 d，期間進行站臺訓練，每天訓練30 min，可自由飲水及進食，避免噪聲。每組篩選出9只訓練合格的小鼠進行造模。

1.2 迷宮訓練

實驗時先將小鼠放入迷宮適應3 min，燈亮時該臂有電，小鼠受電擊后逃到安全區(qū)，此區(qū)內無燈光。燈光持續(xù)10 s后，隨機變化電擊區(qū)，進行下一次測試。每個實驗日連續(xù)測試20次，記錄正確反應次數，所用參數：電壓為50～70 V，延時5 s。各組造模前3天進行每天20次的訓練，取第3天成績作為造模前成績（正確反應次數）；給藥后再進行測試。

1.3 動物模型制備

應用改良多平臺睡眠剝奪法（modified multiple platform method，MMPM）（72 h睡眠剝奪法）制作動物模型：各組從造模第1天，8：00 開始放入睡眠剝奪箱，連續(xù)3 d，至第4天早8：00結束。用大鼠籠[規(guī)格：48 cm（長）×40 cm（寬）×34 cm（高）]自制簡易睡眠剝奪箱，其底面均勻固定9個上表面積2.5 cm×2.5 cm的木平臺。箱內注水，平臺高出水面0.5 cm，水溫保持在室溫24～26℃。箱頂置鐵絲網。每天更換箱中的水。

1.4 主要藥品與試劑

銀杏葉片（每片含總黃酮醇苷19.2 mg，萜類內酯4.8 rag，批號：20070403）：貴州信邦制藥股份有限公司；BDNF試劑盒：武漢博士德；SABC（兔IgG）：武漢博士德；PBS液：北京中杉金橋；DAB顯色劑：武漢博士德。

1.5 實驗處理

空白組：正常睡眠，等量去離子水灌胃5 d；對照組：睡眠剝奪，等量去離子水胃5 d；治療Ⅰ組：睡眠剝奪，EGB 9 ml/10 g灌胃5 d；治療Ⅱ組：睡眠剝奪，EGB 18 ml/10 g灌胃5 d。給藥后第6天開始再次分別對4組小鼠進行行為學檢測。

1.6 免疫組織化學檢測法

造模結束，經行為學檢測，麻醉成功后，將小鼠仰臥固定于手術板上，剪開前胸壁肋骨，暴露心臟，小心分離出升主動脈并在其下穿1根1號手術線備用，將灌注針從心尖插入升主動脈，用準備好的手術線將灌注針固定于升主動脈，在左心耳剪1個小口，輸液器接于灌注針尾部，止血鉗夾閉腹主動脈，小鼠頭低腳高位，快速灌注生理鹽水直至流出液變清，再以4℃的4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，直至小鼠頭頸變硬，快速斷頭取腦，取海馬，連續(xù)冠狀切片，PBS漂洗3次，3 min/次，去離子水沖洗；以3%過氧化氫溶液孵育20 min，PBS漂洗3次，3 min/次；正常羊血清封閉（3∶200，37℃，15 min）；傾去血清，勿洗，滴加一抗（BDNF兔來源）（1∶60，4℃過夜），PBS漂洗3次，3 min/次；滴加二抗（1∶200，37℃），孵育10 min，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加AB液（1∶100， 37℃，40 min），PBS漂洗3次，3 min/次；DAB顯色（1∶20）；最后進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，晾干后進行鏡下觀察、拍照。蛋白表達相對量以灰度值表示。各組隨機選取3只小鼠，每只小鼠隨機選取3個部位，每個部位9個視野，應用ImageJ軟件進行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析，Y迷宮成績、海馬內BDNF蛋白含量用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One Way-ANOVA）檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠給藥前后正確反應次數的比較

Y迷宮測試結果顯示，對照組給藥前后的正確反應次數差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余3組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；給藥后，對照組與治療Ⅰ組、對照組與治療Ⅱ組的正確反應次數差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2 4組小鼠BDNF免疫組織化學染色結果的比較

免疫組織化學染色結果顯示，BDNF主要表達于海馬細胞的細胞質和細胞膜，呈棕黃色的為陽性。對照組與空白組比較，BDNF蛋白表達明顯減少（圖1A、圖1B）。與對照組比較，空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組海馬區(qū)的BDNF表達增高（圖1A～圖1D），其灰度值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組各組間灰度值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖1A、圖1C、圖1D）（表2）。

2.3 SD開始前后4組小鼠精神狀況與活動能力的比較

SD開始前，4組小鼠飼養(yǎng)條件一致，精神狀況與活動能力基本一致，體重持續(xù)增長。SD開始后，對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組精神萎靡、活動減少，且情況持續(xù)加重。SD 72 h，36只小鼠均存活。

3 討論

本實驗中，Y迷宮測試結果顯示，對照組給藥前后的正確反應次數差異有統(tǒng)計學意義，說明SD會造成小鼠學習記憶障礙[9]。給藥后，對照組與治療Ⅰ組、對照組與治療Ⅱ組的正確反應次數差異有統(tǒng)計學意義，說明EGB對SD小鼠學習記憶有改善作用。

免疫組織化學染色結果顯示，EGB可能促進海馬BDNF的表達。小鼠海馬BDNF的表達增高，對小鼠學習記憶有保護作用；EGB可改善SD小鼠學習記憶障礙，可能是通過上調海馬BDNF表達引起的。由此可推測，EGB對改善SD患者的學習記憶障礙有一定作用[10]。目前的研究證實，一定劑量的EGB對認知功能具有改善作用[11-12]。

德國神經生物學家Barde等[13]于1982年首次從豬腦中發(fā)現BDNF，目前研究發(fā)現，BDNF廣泛存在于腦內各個區(qū)域，以海馬和皮質居多，與疼痛[14]、抑郁[15]、學習記憶[16]等相關，而越來越多的研究[17-19]證實，BDNF在學習記憶中占至關重要的地位，可能與長時程增強（LTP）有關。

本實驗中還發(fā)現，SD小鼠雖精神萎靡，但攻擊性增強，可能處于應激狀態(tài)。有研究表明[20]，長期應激可使下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）高激活，進而導致體內糖皮質激素異常增高，與海馬內存在的大量糖皮質激素受體選擇性結合，從而導致海馬結構異常。

綜上所述，EGB可以保護SD小鼠海馬區(qū)神經細胞，上調海馬區(qū)BDNF的表達，提高小鼠的學習記憶能力，且EGB安全性好，無明顯毒副作用，來源充足，價格低廉，因此，EGB可以作為改善SD學習記憶能力的藥物，值得進一步臨床研究。不同劑量EGB對改善SD小鼠學習記憶能力的效果也可作相關研究。

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（收稿日期：2015-09-18 本文編輯：許俊琴）