陳 誠(chéng) 李 明 周耀庭 劉仁慧 師一民（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069）

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小兒喘寶對(duì)哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液Th1／Th2平衡的影響

陳 誠(chéng) 李 明 周耀庭 劉仁慧 師一民
（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069）

摘要目的：研究小兒喘寶對(duì)哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液中Th1／Th2平衡的影響，探索其治療哮喘的作用機(jī)制。方法：采用卵蛋白（OVA）致敏、激發(fā)的方式制作大鼠慢性哮喘模型，以地塞米松為對(duì)照藥。通過(guò)對(duì)哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞涂片中嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）的計(jì)數(shù)，血清及肺泡灌洗液（BALF）中IFN-γ、IL-4含量以及IFN-γ／IL-4比值的測(cè)定，探索小兒喘寶治療哮喘大鼠的作用機(jī)制。結(jié)果：小兒喘寶可減輕大鼠的哮喘癥狀，減少BALF中EOS的數(shù)量，降低血清及BALF中IL-4的含量，升高血清及BALF中IFN-γ的含量，升高IFN-γ／IL-4的比值。結(jié)論：小兒喘寶能升高哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液中IFN-γ／IL-4的比值，從而糾正失衡的Th1／Th2，這可能是小兒喘寶調(diào)節(jié)哮喘的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞小兒喘寶；哮喘；Th1／Th2

The Effect of Xlao'er Chuanbao Decoctlon on the Balance of Th1／Th2 ln Serum and Bronchoalveo Larlavage Fluld of Asthma Rats

Chen Cheng，Li Ming，Zhou Yaoting，Liu Renhui，Shi Yimin
（Traditional Chinese Medicine School of Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract Objectlve：To investigate the effects of Xiao'er Chuanbao decoction on Th1／Th2 balance in asthma rats and its mechanism. Methods：To make the chronic asthma models by Ovalbumin（OVA）sensitizing and stimulating. Dexamethasone was used as the control drug. To explore the mechanism of Xiao'er Chuanbao decoction in treating asthmatic rats by counting the number of eosinophils（EOS）in bronchoalveo larlavage fluid（BALF），determining the contents of IFN-γ，IL-4 in serum and BALF，and calculating the ratio of IFN-γ and IL-4. Results：Xiao'er Chuanbao decoction can relieve asthma symptoms reduce the number of EOS in BALF，raise the level of IL-4 in serum and BALF deduce the level of IFN-γ and increase IFN-γ／IL-4 ratio. Concluslon：Xiao'er chuanbao decoction can rise the ratio of IFN-γ／IL-4，and thus balancing Th1／Th2. This might be its mechanism in treating asthma.

Key Words Xiao'er Chuanbao decoction；Asthma；Th1／Th2

兒童支氣管哮喘是嚴(yán)重威脅兒童身體健康的疾病之一，近年來(lái)由于自然環(huán)境和生活習(xí)慣的改變，該病在我國(guó)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。目前，在我國(guó)有約1 000萬(wàn)左右的兒童罹患該?。?］。國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)周耀庭教授在兒童支氣管哮喘的發(fā)病及治療方面具有獨(dú)到見(jiàn)解，強(qiáng)調(diào)治療兒童支氣管哮喘應(yīng)始終貫徹“祛痰蠲飲”的治療方針。其創(chuàng)制的小兒喘寶是以麻黃、黃芩、瓜蔞、代赭石等藥物為主組成的復(fù)方，在前期臨床運(yùn)用中獲得顯著療效［2］。為進(jìn)一步明確小兒喘寶治療哮喘的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)將從其對(duì)血清和肺泡灌洗液中Th1／Th2平衡的影響角度進(jìn)行研究。

1　資料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，36只，體重（180±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)入，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。各組大鼠喂養(yǎng)常規(guī)飼料，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1. 2 實(shí)驗(yàn)藥物 “小兒喘寶”，麻黃、黃芩、瓜蔞、代赭石等，均購(gòu)自北京同仁堂店，水煎。其中小兒喘寶高劑量為2. 42 g／mL、小兒喘寶中劑量1. 21 g／mL、小兒喘寶低劑量0. 605 g／mL。

醋酸地塞米松片，0. 75 mg／片×100，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：130309，配置成0. 05 g／mL水溶液。

1. 3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 卵蛋白（批號(hào)：SLBG1256V，Sigma）；氫氧化鋁（批號(hào)：201112261，北京化工廠）；IL-4Elisa試劑盒（批號(hào)：230440715，北京環(huán)亞泰克公司）；IFN-γElisa試劑盒（批號(hào)：238041231，北京環(huán)亞泰克公司）；402AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；Biofuge15R離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；MODEL680酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1. 4 動(dòng)物造模與分組 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將其隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組（A組）、哮喘模型組（B組）、激素組（C組）、小兒喘寶高劑量組（D組）、小兒喘寶中劑量組（E組）、小兒喘寶低劑量組（F組），每組6只。采用卵蛋白致敏和霧化激發(fā)的方式建立哮喘模型［3］。除A組外，其余各組分別于實(shí)驗(yàn)的第1天、第8天用新鮮配制的卵蛋白100 mg＋氫氧化鋁200 mg＋生理鹽水1 mL的混懸液分別在大鼠兩側(cè)腹股溝、前足跖做皮下注射，每點(diǎn)0. 2 mL，同時(shí)腹腔注射0. 2 mL，共4點(diǎn)。再于實(shí)驗(yàn)第15～35天，每天喂藥后分批將致敏的大鼠置于密閉容器內(nèi)，給予1%卵蛋白生理鹽水進(jìn)行超聲霧化吸入25 min／d，霧化流量為3 mL／min，連續(xù)21 d，以激發(fā)哮喘。在霧化過(guò)程，各組大鼠出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、呼吸增快、腹肌抽搐等表現(xiàn)。正常對(duì)照組以等量生理鹽水進(jìn)行兩側(cè)腹股溝、前足跖皮下注射、腹腔注射和霧化，方法同上。實(shí)驗(yàn)第36天處死大鼠。

1. 5 給藥方法 從實(shí)驗(yàn)第8天開(kāi)始給各組大鼠灌胃給藥，1次／d。D、E、F組，分別給予小兒喘寶水煎液24 g、12 g、6 g生藥／（kg·d）。C組給予醋酸地塞米松溶液0. 5 mg／（kg·d）。A組和B組給予生理鹽水。以上各組大鼠的給藥量為1 mL／100 g.

1. 6 觀察指標(biāo)與方法 實(shí)驗(yàn)第36天，給藥后1 h，常規(guī)消毒，以10%水合氯醛3. 5 mL／kg對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，待大鼠麻醉后，打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h后，以3 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取血清，用ELISA試劑盒測(cè)定血清中IL-4、IFN-γ的含量（pg／mL）。然后向上打開(kāi)胸腔，向上剪開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離氣管，于環(huán)狀軟骨處剪斷氣管，將5 mL注射器的針管去除，套上藍(lán)色槍頭插入氣管，經(jīng)氣管向肺葉注射冰的生理鹽水4 mL，輕輕按摩肺組織30 s后，緩慢回吸BALF，反復(fù)3次，回收率＞80%，將回收的BALF以1 500 r／min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定血清中IL-4、IFN-γ的含量（pg／mL）。

1. 7 統(tǒng)計(jì)方法 運(yùn)用SPSS 11. 5軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值采用（±s）表示，組間比較采用ANOVA分析，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，不齊者用Dunnett's T3檢驗(yàn)，P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2. 1 一般情況觀察 A組大鼠在受到激發(fā)后呼吸節(jié)律規(guī)整，活躍好動(dòng)，毛色光澤，腹部正常起伏，無(wú)抽搐。B組大鼠受到激發(fā)后出現(xiàn)呼吸急促、加深加快，煩躁不安，咳嗽頻頻，撓鼻，反應(yīng)遲緩，精神不振，毛色光澤差，并有脫毛，腹肌時(shí)有抽搐，腹式呼吸明顯，拱背蜷臥等癥狀。C組和D、E、F組大鼠受到激發(fā)后呼吸略微加快，反應(yīng)較靈敏，略有煩躁、咳嗽，精神尚佳，毛色略顯暗淡，偶有腹肌抽搐。

2. 2 小兒喘寶對(duì)哮喘大鼠BALF細(xì)胞涂片中EOS數(shù)量的影響 與A組比較，B組細(xì)胞涂片里的EOS數(shù)量較A組顯著增多（P＜0. 01）；與B組比較，C組和E、F組EOS數(shù)量顯著減少（P＜0. 01）；與D組比較，F(xiàn)組EOS數(shù)量明顯減少（P＜0. 05）。見(jiàn)表1。

表1　大鼠BALF細(xì)胞涂片中EOS的變化（±s）

表1　大鼠BALF細(xì)胞涂片中EOS的變化（±s）

注：與A組比較△△P＜0. 01；與B組比較**P＜0. 01；與D組比較＃P＜0. 05。

組別　　例數(shù)　EOS數(shù)量／200細(xì)胞A組1. 08±0. 38 B組　6　2. 54±0. 46△△C組　6　1. 25±0. 69**D組　6　2. 08±0. 49 E組　6　1. 33±0. 41**F組　6　1. 17±0. 49**＃6

2. 3 小兒喘寶對(duì)哮喘大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的影響 與A組比較，B組血清中IFN-γ含量較正常組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組比較，C組和E、F組血清中IFN-γ含量有顯著性升高（P＜0. 01）；與D組比較，F(xiàn)組血清中IFN-γ含量有顯著性升高（P＜0. 01）；與E組比較，F(xiàn)組血清中IFN-γ含量有明顯升高（P＜0. 05）。與A比較，B組血清中IL-4含量較A組有顯著性升高（P＜0. 01）；與B組比較，C組和E、F組血清IL-4含量顯著性降低（P ＜0. 01），D組有明顯降低（P＜0. 05）；與D組比較，F(xiàn)組血清IL-4含量有明顯降低（P＜0. 05）。與A組比較，B組動(dòng)物血清中IFN-γ／IL-4比值較A組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組相比，C組和F組血清中IFN-γ／IL-4比值有顯著性升高（P＜0. 01），E組血清中IFN-γ／IL-4比值有明顯升高（P＜0. 05）；與D組相比，F(xiàn)組血清中IFN-γ／IL-4比值有顯著性升高（P＜0. 01）。見(jiàn)表2。

2. 4 小兒喘寶對(duì)哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的影響 與A組比較，B組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量較A組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組相比，F(xiàn)組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量有顯著性升高（P＜0. 01），C組和E組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量有明顯升高（P＜0. 05）；與D組比較，F(xiàn)組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量有明顯升高（P＜0. 05）。與A組比較，B組支氣管肺泡灌洗液中IL-4含量較A組有顯著性升高（P＜0. 01）；與B組比較，C組和F組支氣管肺泡灌洗液中IL-4含量有顯著性降低（P＜0. 01），E組含量有明顯降低（P＜0. 05）；與D組比較，F(xiàn)組支氣管肺泡灌洗液中IL-4要明顯低于D組（P＜0. 05）。與A組比較，B組動(dòng)物支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ／IL-4比值較A組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組相比，E、F組支氣管肺泡灌洗液中的IFN-γ／IL-4比值有顯著性升高（P＜0. 01），C組支氣管肺泡灌洗液中的IFN-γ／IL-4比值較B組有明顯升高（P＜0. 05）；與D組比較，F(xiàn)組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ／IL-4比值有明顯升高（P＜0. 05）。見(jiàn)表3。

表2　大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（±s）

表2　大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（±s）

注：與A組比較△△P＜0. 01；與B組比較*P＜0. 05，**P＜0. 01；與D組比較＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01；與E組比較▲P＜0. 05。

組別例數(shù)　IFN-γ（pg／mL）　IL-4（pg／mL）　IFN-γ／IL-4 A組6　 147. 25±27. 65　 8. 58±4. 59　 7. 86±3. 32 B組　6　 59. 16±15. 32△△17. 74±2. 45△△3. 67±1. 24△△C組　6　 97. 66±32. 50**　7. 38±3. 33**7. 81±2. 42**D組　6　 73. 60±17. 22　 13. 52±2. 29*　5. 45±1. 12 E組　6　 94. 80±12. 70**11. 94±3. 68**6. 96±2. 04*F組　6　 121. 81±16. 13**＃＃▲8. 61±2. 60**＃9. 51±2. 93**＃＃

表3　大鼠支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（-±s）

表3　大鼠支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（-±s）

注：與A組比較△△P＜0. 01；與B組比較*P＜0. 05，**P＜0. 01；與D組比較＃P＜0. 05。

組別例數(shù)　IFN-γ（pg／mL）　IL-4（pg／mL）　IFN-γ／IL-4 A組6　 96. 74±31. 76　 7. 37±2. 57　 9. 96±2. 64 B組　6　 46. 95±10. 83△△　14. 55±4. 43△△3. 40±1. 73△△C組　6　 73. 44±15. 07*　10. 12±2. 60**6. 68±2. 53*D組　6　 60. 81±17. 05　 11. 90±2. 17　 5. 80±1. 05 E組　6　 72. 66±24. 80*　10. 53±1. 56*　7. 18±2. 06**F組　6　 89. 51±18. 92**＃7. 96±1. 92**＃9. 45±2. 14**＃

3　討論

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞和炎性反應(yīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的慢性呼吸道疾病，兒童哮喘主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息、呼吸困難、咳嗽、胸悶，發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜［4］。近來(lái)研究表明，哮喘的發(fā)病過(guò)程與Th活化并分泌多種細(xì)胞因子有密切聯(lián)系，正常情況下Th1和Th2細(xì)胞處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，維持著機(jī)體的正常免疫功能［5］。目前普遍認(rèn)為當(dāng)機(jī)體受到異?？乖碳ず螅琓h1／Th2的正常平衡被打破，此時(shí)Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化、Th1細(xì)胞分化相對(duì)弱勢(shì)，就會(huì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞的趨化、成熟、聚集，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。因此，Th1／Th2失衡是哮喘發(fā)生的重要機(jī)制［6］。

Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子（TNF-α、TNF-β）等細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞，發(fā)生遲發(fā)超敏反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞募集，引起氣道炎性反應(yīng)［7］。在影響哮喘的細(xì)胞因子中，IFN-γ和IL-4是一對(duì)互為拮抗的細(xì)胞因子，IFN-γ能抑制IL-4mRNA轉(zhuǎn)錄，減輕EOS的浸潤(rùn)，降低氣道炎性反應(yīng)，同時(shí)還可以抑制免疫球蛋白的合成，對(duì)氣道起到保護(hù)作用，是Th1細(xì)胞分泌的拮抗哮喘發(fā)作的關(guān)鍵因子。IL-4則能誘導(dǎo)分泌促嗜酸性粒細(xì)胞聚集的細(xì)胞因子和促炎性反應(yīng)因子，加重氣道炎性反應(yīng)、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性，是Th2分泌的重要的促炎性細(xì)胞因子。IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，所以常用IFN-γ／IL-4來(lái)反映Th1／Th2［8-11］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組大鼠BALF細(xì)胞涂片中EOS的數(shù)量較正常組顯著性增多，提示發(fā)生了EOS的大量浸潤(rùn)，出現(xiàn)了嚴(yán)重的氣道炎性反應(yīng)。給予激素和中、低劑量的小兒喘寶后，大鼠BALF細(xì)胞涂片中的EOS數(shù)量較模型組均出現(xiàn)顯著性減少，這說(shuō)明激素和中、低劑量的小兒喘寶均有抑制氣道炎性反應(yīng)的作用。通過(guò)對(duì)大鼠血清的IFN-γ和IL-4檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠的IFN-γ較正常大鼠顯著性降低，IL-4較正常大鼠顯著性升高，這表明Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化，Th2細(xì)胞分化相對(duì)弱勢(shì)，Th1／Th2的正常平衡被打破。但在給予哮喘大鼠中、低劑量的小兒喘寶之后，其血清中的IFN-γ含量比模型組大鼠有了顯著性的上升，且低劑量組比中劑量組上升更明顯；高、中、低劑量的小兒喘寶，均能明顯降低IL-4的含量，其中低劑量組下降最為顯著。對(duì)IFN-γ／IL-4進(jìn)行計(jì)算發(fā)現(xiàn)，中、低劑量組的IFN-γ／IL-4比值均明顯高于模型組。另外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)了大鼠肺泡灌洗液（BALF）中的IFN-γ和IL-4含量，發(fā)現(xiàn)中、低劑量的小兒喘寶均能夠明顯升高哮喘大鼠BALF 中IFN-γ含量，并降低IL-4含量，中、低劑量組的IFN-γ／IL-4比值均明顯高于模型組。本實(shí)驗(yàn)從大鼠整體（血清）和局部（肺泡灌洗液）的角度說(shuō)明：中、低的劑量小兒喘寶可以有效的抑制Th2的活化，并促進(jìn)Th1的生成，使不平衡的Th1／Th2回歸平衡狀態(tài)，從而起到減輕哮喘發(fā)作的效果。

支氣管哮喘病情頑固，遷延難愈，張仲景在《金匱要略》中記載“膈上病痰，滿喘咳吐，發(fā)則寒熱……必有伏飲”。明確提出，哮喘病反復(fù)發(fā)作的病機(jī)是“伏飲”，哮病的發(fā)病是因?yàn)樗尢捣?，外邪引觸，痰氣交阻［12］。伏飲存在于哮喘的發(fā)作期和緩解期，化痰逐飲，消除宿痰是探尋治療哮喘的重要治療原則［13］。小兒素體陽(yáng)盛，受外邪侵襲后容易從火化熱，且小兒常有消化不暢，食滯等癥狀，故臨床上以熱性哮喘較為常見(jiàn)［14］。肺主氣，司呼吸，肺是人體氣機(jī)升降的樞紐。氣機(jī)升降正常，則呼吸通暢，氣機(jī)逆亂，則喘息發(fā)作［15］。周耀庭教授創(chuàng)制的小兒喘寶集解表、清熱、理氣、祛痰于一方以去除頑邪，共奏宣肺平喘、清熱化痰及宣降氣機(jī)之功。

綜上所述：小兒喘寶能糾正哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液中失衡的Th1／Th2。中、低劑量的小兒喘寶能顯著性減少哮喘大鼠BALF細(xì)胞涂片中的EOS數(shù)量，減輕炎性反應(yīng)；同時(shí)可以升高哮喘大鼠血清和BALF中的IFN-γ，降低血清和BALF中的IL-4，從而升高IFN-γ／IL-4比值，逆轉(zhuǎn)失衡的Th1／Th2狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同劑量的小兒喘寶干預(yù)哮喘大鼠模型實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了中、低劑量的小兒喘寶能夠有效的減輕哮喘的發(fā)作，調(diào)節(jié)血清和BALF中的Th1／Th2失衡，這可能是本方治療支氣管哮喘的作用機(jī)制之一，提示小兒喘寶在治療哮喘方面有良好的應(yīng)用前景。

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（2015－09－15收稿 責(zé)任編輯：王明）

作者聲明

本刊2015年第12期第1957頁(yè)，《中醫(yī)高校教育信息化評(píng)估體系優(yōu)化路徑的探討》一文第一作者項(xiàng)馨立單位更改為：1）南京中醫(yī)藥大學(xué)（攻讀研究生單位）；2）江蘇省第二師范學(xué)院（工作單位）。特此聲明！

中圖分類號(hào)：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 032

通信作者：李明（1963. 11—），女，大學(xué)本科，副教授，研究方向：方劑配伍規(guī)律及功效機(jī)制研究，E-mail：13611386113＠163. com

作者簡(jiǎn)介：陳誠(chéng)（1990. 06—），男，碩士研究生，研究方向：方劑配伍規(guī)律及功效機(jī)制研究，E-mail：chengchen5790＠163. com

基金項(xiàng)目：北京市教育委員會(huì)2014年首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)（編號(hào)：14ZY03）；北京中醫(yī)藥“薪火傳承3＋3工程”周耀庭名老中醫(yī)工作室項(xiàng)目；周耀庭全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目