王士勇

（黑龍江省巴彥縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江巴彥 151800）

應(yīng)用核型分析法鑒定家畜胚胎性別

王士勇

（黑龍江省巴彥縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江巴彥 151800）

核型分析是根據(jù)動(dòng)物染色體著絲點(diǎn)位置、臂比、染色體長(zhǎng)度、隨體的有無(wú)等特征，并借助染色體分帶技術(shù)對(duì)某一生物的染色體進(jìn)行比較、分析、排序和編號(hào)。其分析以體細(xì)胞分裂中期染色體為研究對(duì)象。染色體組型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間關(guān)系所不可缺少的重要手段。

家畜；胚胎；核型分析法；鑒定

1 鑒別原理

不同物種的染色體都有各自特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括染色體的長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)位置、臂比、隨體大小等特征，而且這種形態(tài)特征是相對(duì)穩(wěn)定的。經(jīng)行核型分析后，可以根據(jù)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異來(lái)判斷生物的病因，比如是由于缺少了什么樣的基因才導(dǎo)致的這種疾病。以動(dòng)物胚胎性別鑒定為目的的核型分析常一般采用切割胚（晚期桑葚胚、囊胚或擴(kuò)張囊胚），一半用于鑒定性別，另一半用于移植或冷凍。如果目的是為了擴(kuò)張囊胚，切割時(shí)可切成含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的半胚和含滋養(yǎng)層細(xì)胞的半胚，前者用于冷凍、移植，后者用于核型分析。

2 分割胚胎

在牛，以非手術(shù)法采集7日齡胚胎，選擇活力強(qiáng)、發(fā)育正常的胚胎以備切割。用2%鏈霉蛋白酶處理1分鐘以脆化透明帶，在顯微操作儀下切割胚胎。其中一半裝人透明帶，在37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)以備移植，或用牛的血清瓊脂包埋以便冷凍。另一半亦裝入透明帶，用于核型分析。

3 半胚預(yù)培養(yǎng)及有絲分裂阻滯

擬作核型分析的半胚在含20%滅活FCS的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)15h（用培養(yǎng)皿或96孔板培養(yǎng)）。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間與半胚性別鑒定率顯著相關(guān)。預(yù)培養(yǎng)2h、6h和15h，對(duì)半胚的性別鑒定率分別為25%、81%和95%。

預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，加入有絲分裂阻斷劑繼續(xù)培養(yǎng)，使有絲分裂停止在分裂中期。常用的分裂阻斷劑有秋水仙素、去甲秋水仙素、長(zhǎng)春花堿或硫酸長(zhǎng)春花堿與鬼臼毒素（V-P）。分裂阻斷劑的濃度和處理時(shí)間對(duì)分裂相的產(chǎn)生和染色體分散程度關(guān)系極大。如果濃度不夠或處理時(shí)間過(guò)短，則標(biāo)本中分裂相少；如濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖然標(biāo)本中分裂相多，但其染色體收縮得太短，難于計(jì)數(shù)和分析。各種阻斷劑有其獨(dú)自的最適濃度和處理時(shí)間。因此，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和所用培養(yǎng)液，對(duì)分裂阻斷劑的濃度和作用時(shí)間進(jìn)行比較，以便獲得既有足夠的分裂中期相，又有長(zhǎng)度適合的染色體。

在對(duì)牛體外受精的2細(xì)胞胚進(jìn)行核形分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，V-P優(yōu)于去甲秋水仙素。當(dāng)在M199中加入0.08μg/mlV-P或0.04μg/ml去甲水仙素阻斷分裂時(shí)，核型分析率分別為69.1%和42.9%。他進(jìn)一步比較了用0.08μg/mlV-P處理胚胎的時(shí)間對(duì)核型分析率的影響，在處理4h、8h和12h以后，核型分析率分別為50.0%、81.5%和100%。據(jù)此認(rèn)為，以0.08μg/mlV-P處理12h為更為合適。然而，有關(guān)科研人員在對(duì)切割后的早期桑葚胚和囊胚進(jìn)行性別鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，去甲秋水仙素優(yōu)于長(zhǎng)春花堿，其半胚性別鑒定率分別為87%和46%。其處理?xiàng)l件是在培養(yǎng)液中含0.04μg/ml去甲秋水仙素，處理4h?？蒲腥藛T用小鼠擴(kuò)張囊胚比較了秋水仙素在不同培養(yǎng)液中的作用。將秋水仙素以0.4μg/ml的濃度，分別溶解于BMOC-3、MEM+20%FCS和PBS+20%FCS中分裂阻滯處理2h，其每枚胚胎中期分裂相分別為2.2～10.6、0.3～7.3和-0.1～6.9，故認(rèn)為BMOC-3是秋水仙素理想的培養(yǎng)液。他還比較了不同秋水仙素濃度、不同作用時(shí)間對(duì)核型分析的影響，發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，中期分裂相增加，但由于細(xì)胞退化而使細(xì)胞核反而減少。故建議小鼠胚胎以每1mlBMOC-3中含0.4μg秋水仙素、培養(yǎng)2h為宜。但將此法用于牛胚胎核型分析時(shí)，中期分裂相獲得率為81.0%（34/32），性別鑒定率僅為38.2%（13/42）?？磥?lái)不同的動(dòng)物也許有各自的最佳條件。

4 染色體標(biāo)本制作

將經(jīng)分裂阻斷劑處理后的半胚移入0.88%或0.9%的檸檬酸鈉溶液中處理7min，使細(xì)胞膨脹、染色體分開(kāi)，然后將該半胚移到干凈無(wú)油脂載玻片的一個(gè)低滲小滴中，再加第一固定液（甲醇：醋酸：無(wú)離子水＝3：2：1）固定處理1min，最后將第二固定液（醋酸）直接加到半胚上，溶解透明帶，使胚細(xì)胞分散，37℃風(fēng)干1min。

5 染色及鏡檢

風(fēng)干后的標(biāo)本以pH 7.0左右的PBS配制的10%吉姆薩染色液染色，晾干后直接用中性樹(shù)膠封固成永久性標(biāo)本。也可將玻片標(biāo)本先經(jīng)二甲苯透明后再封固。染色體標(biāo)本在100倍顯微鏡下檢查。各種家畜的染色體數(shù)目（常染色體加性染色體）有所不同，性染色體的形態(tài)亦各有特點(diǎn)。牛、馬、綿羊、山羊和豬的染色體總數(shù)分別為60、64、54、60和38，其中均含有一對(duì)性染色體（XX或XY）。一般X染色體較大，Y染色體很小。各種家畜性染色體的特征描述如下。

對(duì)于家牛，X染色體特征：大，亞中部著絲粒大；Y染色體特征：小，中部著絲粒。對(duì)于瘤牛，X染色體特征：大，亞中部著絲粒；Y染色體特征：小，亞端部著絲粒。對(duì)于山羊，X染色體特征：大，亞端部著絲粒（具有微小短臂）；Y染色體特征：微小，中部著絲粒。對(duì)于豬，X染色體特征：中等大小，中部著絲粒；Y染色體特征：小，中部著絲粒。對(duì)于綿羊，X染色體特征：大，亞端部著絲粒；Y染色體特征：微小，中部著絲粒。對(duì)于馬，中等大小，亞中部著絲粒；Y染色體特征：小，亞端部著絲粒。

核型分析是一項(xiàng)很細(xì)致的研究工作，在進(jìn)行性別判定時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格依據(jù)各種家畜性染色體的特征認(rèn)真觀察比較各種動(dòng)物（特別是家畜肋動(dòng)物，如牛、綿羊、豬、家兔等）的染色體特征，可供胚胎性別鑒定時(shí)參考。

[1]田萬(wàn)強(qiáng)，魏紅芳，昝林森.家畜早期胚胎性別鑒定方法在畜牧業(yè)中的應(yīng)用[J].黃牛雜志，2001，27（5）：43-46.

王士勇（1971—），男，黑龍江巴彥縣人，本科，高級(jí)畜牧師，主要從事畜牧工作。