孫麗麗

（山東省榮成市蔭子畜牧獸醫(yī)站，山東榮成 264300）

山東省某養(yǎng)雞場禽流感發(fā)病情況的調(diào)查

孫麗麗

（山東省榮成市蔭子畜牧獸醫(yī)站，山東榮成 264300）

禽流感（avinaninuenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野鳥）的傳染性疾病。在各種禽類中的流行有多種表現(xiàn)形式，可見亞臨診癥狀、輕度上呼吸道感染以及急性致死性等。本實驗調(diào)查了實習(xí)養(yǎng)雞場中雞群禽流感免疫效果和發(fā)病狀況，為禽流感的預(yù)防和治療提供一定的指導(dǎo)作用。

A型流感病毒；預(yù)防；治療

1 材料與方法

1.1 試驗材料

禽流感H5標(biāo)準(zhǔn)毒株、陰性血清和陽性血清均有哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；禽流感診斷試劑盒由武漢科前動物生物制品有限公司生產(chǎn)；棉拭子，96孔微量反應(yīng)板，瓊脂糖均有實習(xí)公司提供。

1.2 試劑的制備

1%雞紅細(xì)胞懸浮液制備：采集至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血清與等體積的阿氏液混合，用PH7.2 0.01mol/LPBS洗滌3～5次，每次均以1000轉(zhuǎn)/min離心10min，將最后一次離心得到的紅細(xì)胞，用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸浮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

pH7.2 0.01mol/LPBS的制備：（1）配置25×PB：稱取2.71g磷酸氫二鈉和0.79g磷酸二氫鈉加蒸餾水至1000ml；（2）配置1×PBS：量取40mol25×PB，加入加入8.5g氯化鈉，加蒸餾水至1000ml，用氫氧化鈉調(diào)至PH7.2，滅菌或過濾。PBS一經(jīng)使用，于4℃保存不超過3周。

阿氏液：（Alsevers）制備：葡萄糖2.05g，檸檬酸0.055g，氯化鈉0.12g，加蒸餾水至100ml，散熱溶解后調(diào)至PH6.1，69KPa高壓滅菌15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

瓊脂板的制備：稱取進(jìn)口瓊脂1.0g加入100mlPH7.2、0.01mol/ LPBS中，在水浴鍋加熱充分融化，加入8.0g氯化鈉，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml，冷卻至45℃～50℃時，倒入平皿制成3mm厚的瓊脂板。

1.3 樣品采集與處理

分別從2個養(yǎng)殖場采取20只40日齡雞的血樣和泄殖腔拭子及喉頭拭子，同一場分為一組，記為組一、組二，分別為每組中各只雞編號，記為1、2、3至20。血液離心取血清備用；喉頭拭子和泄殖腔拭子用無菌棉拭子于禽類喉頭或泄殖腔中蘸取滲出液，然后浸泡于1ml樣品處理液中，劇烈震蕩1min后，擠出棉拭子中的液體，棄棉拭子，液體凍融3次后于36～38℃作用15min，在2～8℃下以12000r/min離心5min，取上清待檢。

1.4 微量血凝試驗（HA）

取干凈的96孔微量反應(yīng)板一塊，操作如下：（1）用微量移液管向微量反應(yīng)板第1行每孔加入PBS25μl；（2）微量移液器吸取禽流標(biāo)準(zhǔn)H5抗原25μl加入孔1，用移液器反復(fù)吹打8～10次混勻，吸取25μl于孔2，再次吹打混勻后吸取25μL于孔3，如此依次稀釋到孔11，孔11混勻后吸出25μl棄掉，換吸頭。孔12不加抗原，只加PBS做紅細(xì)胞對照；（3）每孔再加PBS25μl；（4）每孔各家體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸浮液（充分搖勻）加入25μl立即置微量振蕩器上混勻1～2min。置20～25℃條件下靜置20min后觀察結(jié)果。紅細(xì)胞對照孔將成明顯的紐扣狀沉到孔底。

結(jié)果判定：將微量反應(yīng)板傾斜45度觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌，完全血凝（不流淌）的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位（HAU）。

1.5 微量血凝抑制試驗（HI）

取干凈的96孔微量反應(yīng)板一塊，操作如下：（1）根據(jù)血凝試驗的測定結(jié)果配置4HAU的病毒抗原。以完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，重點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原稀釋倍數(shù)。（2）用微量移液器自第1列孔至第11列孔加入25μlPBS，第12列孔加入25μlPBS。（3）用微量移液器吸取被檢血清25μl加入第1列孔，用移液器反復(fù)吹打8～10次混勻，吸取25μl于第2孔，再次吹打混勻后吸取25μl于孔3，如此依次稀釋到第10孔，混勻后吸出25μL棄掉。（4）1～11列孔均再加入含4個血凝單位抗原液25μl，第12列孔為紅細(xì)胞對照，不加抗原。（5）立即置振蕩器上振蕩混勻1～2min，于22～25℃條件下靜置感作20min。（6）每孔再加入1%雞紅細(xì)胞懸浮液25μl（混勻后加入），置振蕩器上振蕩1～2min，于22～ 25℃條件下靜置感作20分鐘后判定結(jié)果。紅細(xì)胞對照將成明顯的扣狀沉淀到孔底。（7）每次試驗應(yīng)設(shè)已知滴度的陽性血清、陰性血清、紅細(xì)胞對照和抗原對照。

結(jié)果判定：

將反映板傾斜45°，沉于孔底得紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或者不被抗原凝集；如果孔底得紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動，說明紅細(xì)胞被抗原凝集。

檢查各種對照：陰性對照孔血清滴度不大于22，陽性對照孔血清誤差不超過一個滴度，紅細(xì)胞對照無血凝現(xiàn)象檢查結(jié)果才有效。HI效價小于或等于23判定HI試驗陰性；HI效價等于24可疑，需重復(fù)試驗；HI效價大于或等于24為陽性。

在對照出現(xiàn)正確的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該血清的血清抑制滴度。能將4單位抗原凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價，用被檢血清稀釋倍數(shù)表示。

1.6 瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗（AGID）

（1）打孔：用打孔器在瓊脂板上按6角圖案打孔，孔徑、孔距為3mm，瓊脂面朝上，玻片在酒精燈上過兩遍，燙手即可，以防瓊脂凝膠與玻片間有空隙，使樣品漏出。（2）加樣：用微量移液器吸取瓊脂抗原滴加入中間孔，陽性血清加入周圍1，4空中，被檢血清按編號順序分別加入另外4個外周孔（2，3，5，6）每孔均以加滿不溢出為度，每加一個樣品換一個吸頭。（3）作用：加樣完畢后，靜置5～10分鐘待孔中液體吸干后，將培養(yǎng)皿輕輕放入加蓋濕盒內(nèi)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中作用24～72h分別在24h、48h、72h對光觀察結(jié)果，并記錄。

結(jié)果判定：

陽性：陽性血清與抗原孔之間有明顯致密的沉淀線時，被檢血清與抗原之間也形成沉淀線，或者陽性血清的沉淀線末端向毗鄰的被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎者，此被檢血清判定為陽性（+）

弱陽性：被檢血清與抗原孔之間沒有沉淀線，但陽性血清的沉淀線末端被檢血清孔偏移。此被檢血清判定為弱陽性（需重復(fù)試驗）如重復(fù)試驗還是弱陽性，則判為陰性（-）。

陰性：被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，或者陽性血清的沉淀線向毗鄰的被檢血清孔直伸或向外側(cè)偏彎者，此被檢血清判定為陰性（—）。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

（1）取酶標(biāo)板（根據(jù)樣品多少可拆開分次使用），將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，洗板1次（200μl/孔）后拍干；（2）加入待檢樣品，每孔100μl，同時設(shè)陰、陽性對照孔，每孔100μl，各1孔，置36～38℃作用30min；（3）洗滌5次，每次200μl/孔，每次約3min；（4）加入一抗（兔抗AIV-NP），100μl/孔，置36～38℃作用30min；（5）洗滌5次，每次200μl/孔，每次約3min；（6）加入羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體，100μl/孔，置36～38℃作用30min；（6）洗滌5次，每次200μl/孔，每次約3min；（7）每孔加底物液A、底物液B各一滴（約50μl），混勻，室溫（20～25℃）避光顯色10min；（7）每孔加入終止液一滴（約50μl），混勻后測定結(jié)果。

結(jié)果判定：在酶標(biāo)儀上測各孔的OD630nm值。試驗成立的條件是：陽性對照孔的OD630nm值≥0.8，且≤2.0；陰性對照孔的OD630nm值＜0.2。樣品OD630nm值＞0.3時判為陽性；樣品OD630nm值≤0.3時判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微量血凝抑制試驗（HA）結(jié)果

兩組各20只40日齡雞實驗結(jié)果批次差異不大，最小6，最大9，說明2個種雞場之間的免疫水平相差不大，該公司對種雞禽流感的預(yù)防工作觀念和認(rèn)識存較高，2個種雞場的免疫程序做的也較好。

2.2 瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗（AGID）結(jié)果

AGID檢測結(jié)果：用標(biāo)準(zhǔn)AI高免血清與40份待檢樣品做AGID試驗，所檢測的樣本均含有流感病毒抗體。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）結(jié)果

ELISA檢測結(jié)果：兩組各20只40日齡雞ELSA血清OD630值，試驗結(jié)果都為陽性，OD值大多都超過0.7。

3 討論

禽流感，特別是高致病性禽流感，自從被發(fā)現(xiàn)以來，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失，由于禽流感病毒自身這些毒株已經(jīng)發(fā)生了變異，其基因序列氨基酸已經(jīng)發(fā)生了兩重甚至是三重的重組，有傳染給人的潛在威脅，而且各亞型在陸禽和水禽之間的相互傳播更加快了病毒基因的重組，這種重組給目前禽流感亞型的防制帶來了困難，可能會在下次的流感大流行中扮演重要角色，所以加強(qiáng)亞型毒株的變異株的監(jiān)測意義。

本次試驗通過對山山東省聊城市的兩家種雞場進(jìn)行HI、AGID、ELISA等試驗檢測，研究該地區(qū)禽流感發(fā)病情況。試驗結(jié)果顯示：兩個種雞場雞群都具有較高禽流感的抗體，HI效價都大于4log2，即免疫合格。因此可以判定，兩家種雞場禽流感的免疫效果較好，無禽流感的發(fā)病情況。

[1]季大平，李超，劉立濤.山東省部分地區(qū)產(chǎn)蛋雞群低致病性禽流感免疫狀況調(diào)查[J].Shandong Journal of Animal Sciences& sveterinary Medicine，2013，（3）：48-49.