廖　健，張　順，龍水生，黃承勤，郭昱嵩，王中鐸，劉楚吾（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江　524025）

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5種蝦虎魚類線粒體COI基因序列變異及系統(tǒng)進(jìn)化

廖健，張順，龍水生，黃承勤，郭昱嵩，王中鐸，劉楚吾
（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524025）

摘要：獲得雷州半島紅樹林海區(qū)5種蝦虎魚稚幼魚的45條線粒體COI基因序列，其T、C、A、G堿基平均含量分別為29.9%、28.4%、23.9%、17.8%。45條序列共定義23個(gè)單倍型，其中檢測到變異位點(diǎn)184個(gè)，雙帶縞蝦虎魚（Tridentiger bifasciatus）單倍型比例最高（80.0%）,湖棲鰭蝦虎魚（Gobiopterus lacustris）單倍型比例最低（18.2%）。Kimura 2-parameter遺傳距離顯示，種間遺傳距離為0.137 6～0.263 5，種內(nèi)遺傳距離為0.000 0～0.020 8。NJ進(jìn)化樹及ML進(jìn)化樹均表明，聚為5大支系的蝦虎魚類中，阿部氏鯔蝦虎魚（Mugilogobius abei）與諸氏鯔蝦虎魚（M.chulae）親緣關(guān)系最近，湖棲鰭蝦虎魚與其他4種蝦虎魚的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。基于群體內(nèi)等位基因頻率分布的中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，雙帶縞蝦虎魚（Tridentiger bifasciatus）、小口擬蝦虎魚（Pseudogobius masago）、阿部氏鯔蝦虎魚、諸氏鯔蝦虎魚4個(gè)群體存在大量低頻等位基因位點(diǎn)，而湖棲鰭蝦虎魚群體以中等頻率等位基因?yàn)橹鳌?/p>

關(guān)鍵詞：蝦虎魚；線粒體；COI基因；系統(tǒng)進(jìn)化

Key words:goby; Mitochondria; COI gene; Phylogenetic

蝦虎魚類是蝦虎魚亞目全部物種的統(tǒng)稱，是鱸形目魚類中最大的類群[1]。其適應(yīng)力強(qiáng)，分布廣泛，從淡水湖泊、溪流到海洋生態(tài)系統(tǒng)均有分布，海陸交錯(cuò)的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是蝦虎魚類主要的棲息場所。全球蝦虎魚類主要集中在熱帶、亞熱帶、溫帶水域，個(gè)別種類僅在小范圍水域出現(xiàn)，如湖棲鰭蝦虎魚（Gobiopterus lacustris）目前僅發(fā)現(xiàn)于菲律賓。蝦虎魚類主要攝食鉤蝦、枝角類、橈足類[2]，同時(shí)為洄游魚類幼魚提供了生物餌料[3]，在很大程度上維持紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量傳遞。然而蝦虎魚類種類繁多，群體間形態(tài)高度相似，難以準(zhǔn)確進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因序列輔助分類已廣泛的應(yīng)用于物種分類，分子數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)形態(tài)分類的結(jié)合較好解決了近緣物種難以界定問題[4-5]。目前，關(guān)于蝦虎魚類形態(tài)學(xué)分類已有較系統(tǒng)研究，而未見蝦虎魚類分子生物學(xué)方面的報(bào)道。線粒體基因組（mtDNA）是位于真核生物核外的遺傳物質(zhì)，具有結(jié)構(gòu)簡單、分子小、進(jìn)化快以及母系遺傳等特征，細(xì)胞色素氧化酶I基因是mtDNA上進(jìn)化速率適中的一段，是系統(tǒng)進(jìn)化研究的優(yōu)質(zhì)分子標(biāo)記。本研究采集雷州半島紅樹林海區(qū)的5種蝦虎魚類，通過獲取COI基因作為分子標(biāo)記，初步分析它們的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為蝦虎魚類的生物學(xué)保護(hù)和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

蝦虎魚稚幼魚，于2014年4月至2015年4月用孔徑149 μm的手抄網(wǎng)分別采自雷州半島沿岸的高橋鎮(zhèn)紅樹林保護(hù)區(qū)，下六鎮(zhèn)紅蒔地、附城鎮(zhèn)北家村、調(diào)風(fēng)鎮(zhèn)九龍山濕地保護(hù)區(qū)，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇固定或鮮活帶回實(shí)驗(yàn)室，在OLYMPUS體視鏡下觀察。對(duì)于已有成魚形態(tài)的稚幼魚，根據(jù)體形、體紋、頭形（吻形、眼）、尾形、透明度、腹鰭是否愈合及有無吸盤等易于辨識(shí)的形態(tài)特征進(jìn)行初步分類、標(biāo)號(hào)、拍照（佳能500D）、保存。初步物種鑒定主要參照文獻(xiàn)[1,6-7]及FishBase等。最終的中文名、分類地位確認(rèn)參照《拉漢世界魚典》[8]。

1.2基因組DNA提取

取-80℃凍存（或新鮮）蝦虎魚肌肉組織0.5 g，采用傳統(tǒng)苯酚-氯仿法提取DNA[9]，提取的DNA經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測定量合格后，于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3COI基因擴(kuò)增和測序

采用通用引物對(duì)COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正、反向引物序列分別為：Fish F，5′-TCAACCAAC CACAAAGACAATGGCAC-3′；Fish R，5′-TAG ACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′[10]。引物由上海生工生物有限公司合成。反應(yīng)體系為：10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、5 μmol/L引物各1 μL、DNA模板1 μL、500 u/L Taq DNA聚合酶0.2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。程序設(shè)置為：94 ℃ 1 min 20 s；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測序。

1.4數(shù)據(jù)分析

利用MEGA6.0對(duì)所獲得的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，人工核查后，對(duì)所得序列的堿基組成、遺傳顛換值、變異位點(diǎn)、單一突變位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算個(gè)體間的Kimura 2-parameter遺傳距離。采用Modeltest 軟件確定最適合的進(jìn)化模式[11]。分別采用鄰位連接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大似然法（Maximum Likelihood method，ML）構(gòu)建進(jìn)化樹。NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹Bootstrap 置信值重復(fù)抽樣1 000次，ML法Bootstrap分析重復(fù)抽樣100次[12]，兩種方法均采用Modeltest獲得的參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用DAMBE進(jìn)行替代飽和性檢驗(yàn)，并以轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)為縱坐標(biāo)，TN93法校正后的遺傳距離為橫坐標(biāo)構(gòu)建散點(diǎn)圖。分子水平自然選擇作用的檢測采用基于群體內(nèi)等位基因頻率分布的中性檢驗(yàn)。采用DnaSP v5軟件對(duì)單倍型數(shù)目、單倍型多樣性、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1樣本分類

樣本經(jīng)形態(tài)學(xué)分類，分別為鯔蝦虎魚屬的阿部氏鯔蝦虎魚（Mugilogobius abei）和諸氏鯔蝦虎魚（M.chulae）、擬蝦虎魚屬的小口擬蝦虎魚（Pseudogobius masago）、縞蝦虎魚屬的雙帶縞蝦虎魚（Tridentiger bifasciatus），樣本a僅能確定到鰭蝦虎魚屬（Gobiopterus）（圖1）。

圖1　5種蝦虎魚類Fig.1　Five species of Gobiidae

將獲得的COI序列與NCBI及BOLD中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，相似度在98%至100%之間，形態(tài)鑒定至種的4種蝦虎魚與分子鑒定結(jié)果一致，而鰭蝦虎魚屬的樣本a經(jīng)條形碼鑒定，以及與NCBI 及BOLD數(shù)據(jù)庫結(jié)果比對(duì)，與Gobiopterus lacustris相似度分別為99%、99.05%，且該屬僅有2個(gè)種，結(jié)合形態(tài)結(jié)果和分子數(shù)據(jù)可確定為湖棲鰭蝦虎魚（Gobiopterus lacustris）。對(duì)COI序列進(jìn)行整理歸納，得到5種蝦虎魚的45條COI序列，上傳至GenBank獲取登錄號(hào)KT923713-KT923757（表1）。

2.2線粒體COI基因片段序列分析

用于測序的5個(gè)物種45個(gè)樣本經(jīng)人工核查、對(duì)位排列以及剪切得序列長540 bp，編碼氨基酸180個(gè)，與GenBank中數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比較，相似度均大于98%，與BOLD數(shù)據(jù)庫中比較相似度在98.44% ～100%。比較5種蝦虎魚的COI序列顯示，在540個(gè)核苷酸序列中，未出現(xiàn)插入、缺失及終止密碼子。變異位點(diǎn)184個(gè)，包括單一突變位點(diǎn)12個(gè)，簡約信息位點(diǎn)172個(gè)。在堿基組成上，T、C、A、G平均含量分別為29.9%、28.4%、23.9%、17.8%。A+T含量（53.8%）高于C+G（46.2%）。這與其他魚類mtDNA COI基因同源序列的堿基特點(diǎn)相似[13-15]。

2.3群體序列變異情況及遺傳距離

分析單倍型數(shù)目、單倍型多樣性、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異，結(jié)果表明，45個(gè)序列測得23個(gè)單倍型，單倍型比例為51.1%。5種蝦虎魚中雙帶縞蝦虎魚單倍型比例最高（80.0%），湖棲鰭蝦虎魚單倍型比例最低（18.2%）（表2）。與單倍型比例相似，雙帶縞蝦虎魚與小口擬蝦虎魚單倍型多樣性較高，分別為0.900±0.161和0.917±0.092，而湖棲鰭蝦虎魚最低，為0.545±0.072。5種蝦虎魚的核苷酸多樣度均較低，其中小口擬蝦虎魚最高（0.006 6），湖棲鰭蝦虎魚最低（0.001 0）。平均核苷酸差異仍是小口擬蝦虎魚最高（3.556），而湖棲鰭蝦虎魚依然最低（0.545）。

表2　5種蝦虎魚類線粒體 COI 基因序列分析的統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 2　Statistical parameters of mtDNA COI gene in the five species of Family Gobiidae

利用MEGA6.0計(jì)算5種蝦虎魚45條COI基因部分序列的Kimura 2-parameter模式最大似然法估計(jì)轉(zhuǎn)換顛換值為1.58。并對(duì)5個(gè)蝦虎魚物種23個(gè)單倍型的45條序列進(jìn)行遺傳距離分析，結(jié)果顯示，平均種間遺傳距離為0.075 9～0.255 2，其中湖棲鰭蝦虎魚與雙帶縞蝦虎魚遺傳距離最大(0.255 2)，阿部氏鯔蝦虎魚與諸氏鯔蝦虎魚遺傳距離最?。?.075 9）。平均種內(nèi)遺傳距離在0.001 0～0.006 7，其中湖棲鰭蝦虎魚種內(nèi)遺傳距離最?。?.001 0），小口擬蝦虎魚遺傳距離最大（0.006 7）（表3）。轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)對(duì)遺傳距離散點(diǎn)圖（圖2）表明，隨遺傳距離的增加，轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)均增大，顛換數(shù)增加速率大于轉(zhuǎn)換數(shù)，具有較強(qiáng)的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)，可用于系統(tǒng)進(jìn)化分析。

表3　5種蝦虎魚類線粒體COI基因序列平均遺傳距離Table 3　Average genetic distance of mtDNA COI sequences among the five species of Family Gobiidae

圖2　5種蝦虎魚的45條COI基因堿基替換飽和分析Fig.2　Substitution saturation in the COI gene of the five species of Family Gobiidae

2.4分子系統(tǒng)進(jìn)化

以COI基因部分序列為標(biāo)記，用鱸形目的長棘銀鱸（Gerres filamentosus）作外群，構(gòu)建的NJ及ML系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。圖3表明，基于COI基因部分序列構(gòu)建的NJ與ML進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本保持一致，5種蝦虎魚聚為5個(gè)支系，與外群分開，同種蝦虎魚不同個(gè)體聚為一支。NJ樹和ML樹均顯示阿部氏鯔蝦虎魚（MA）與諸氏鯔蝦虎魚（MC）親緣關(guān)系較近，先聚為1支，再與小口擬蝦虎魚（PM）聚為1支，然后與雙帶縞蝦虎魚聚為1支，而與湖棲鰭蝦虎魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.5中性檢驗(yàn)

檢測5種蝦虎魚群體是否偏離中性進(jìn)化，結(jié)果顯示，雙帶縞蝦虎魚、小口擬蝦虎魚、阿部氏鯔蝦虎魚、諸氏鯔蝦虎魚的Tajima’s D值均為負(fù)（表4），表明它們存在大量的低頻等位基因位點(diǎn)，推測可能是由負(fù)選擇（Negative selection）、輕微分離的有害突變或群體擴(kuò)張所引起。而湖棲鰭蝦虎魚的Tajima’s D值為正，表明該種群內(nèi)由中等頻率的等位基因占主導(dǎo)，可能是平衡選擇的結(jié)果，或是種群大小在經(jīng)歷瓶頸時(shí)稀有等位基因丟失所致。但5種蝦虎魚類的檢驗(yàn)結(jié)果均顯著（P ＜ 0.05），不符合中性進(jìn)化假設(shè)。

圖3 基于COI基因的部分序列構(gòu)建的5種蝦虎魚類NJ(a)和ML(b)系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Reconstruction of NJ(a)and ML(b)phylogenetic trees of the five species of Gobiidae Family based on mitochondrial COI gene fragments

表4　5種蝦虎魚類mtDNA COI基因序列的中性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4　Neutrality tests of the five species of Gobiidae Family

3　討 論

3.1系統(tǒng)進(jìn)化分析

mtDNA在遺傳進(jìn)化分析中起重要作用。據(jù)所受選擇壓力不同，mtDNA中各區(qū)域的進(jìn)化速率不同。如進(jìn)化速率較快的D-loop適于群體遺傳學(xué)及近緣物種或種內(nèi)群體分析[16]，相對(duì)保守的COI、12S rRNA、16S rRNA等適于種屬間或分類階元較高的物種間探討[17-18]。本研究以COI為標(biāo)記獲得5種蝦虎魚45條序列，從遺傳距離來看，諸氏鯔蝦虎魚種內(nèi)分化程度最高，而湖棲鰭蝦虎魚種內(nèi)分化程度最低。諸氏鯔蝦虎魚與湖棲鰭蝦虎魚親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與阿部氏鯔蝦虎魚親緣關(guān)系最近。從分子進(jìn)化樹來看，諸氏鯔蝦虎魚與阿部氏鯔蝦虎魚進(jìn)化關(guān)系最近，而湖棲鰭蝦虎魚位于系統(tǒng)發(fā)育樹的基部位置，表明其在進(jìn)化上較為原始或較早分化出來。依據(jù)《中國動(dòng)物志》[1]記載，鯔蝦虎魚屬的阿部氏鯔蝦虎魚與諸氏鯔蝦虎魚的胸鰭、腹鰭、尾鰭鰭條數(shù)較多，鰓部有假鰓，鰓耙短小，是較特化、較晚形成的物種。而湖棲鰭蝦虎魚胸鰭、腹鰭、尾鰭鰭條相對(duì)較少，下頜顯著向上突出，長于上頜，鰓部無假鰓，具多個(gè)近祖特征，是較原始種[1]。由此看來，用COI基因序列標(biāo)記分析的蝦虎魚進(jìn)化結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類研究一致，證明線粒體COI基因在蝦虎魚類系統(tǒng)進(jìn)化分析研究上的可行性。

3.2物種地理分布問題

鱸形目是硬骨魚類較大的一支，而蝦虎魚又是鱸形目魚類中最大的類群。由于種類繁多，關(guān)于蝦虎魚的研究僅見局部水域研究和零星報(bào)道。國內(nèi)比較系統(tǒng)的蝦虎魚類研究成果主要有伍漢霖等[7]的《中國動(dòng)物志》。該文獻(xiàn)記述了中國所產(chǎn)蝦虎魚類的9科5亞科106屬307種（含1新種），描述了研究簡史、形態(tài)特征、生態(tài)學(xué)特征、區(qū)系組成與地理分布、分類系統(tǒng)與演化和經(jīng)濟(jì)利用等。但由于編集委員會(huì)資料收集、樣本采集等有限，難免存在疏漏。本研究采集的5種蝦虎魚中，個(gè)別種類在地理分布上存在爭議。例如廣泛存在于雷州半島的湖棲鰭蝦虎魚在該文獻(xiàn)中無記錄，該文獻(xiàn)指出產(chǎn)于中國的鰭蝦虎魚屬僅大鱗鰭蝦虎魚，同時(shí)FishBase指明，湖棲鰭蝦虎魚僅在菲律賓呂宋島的淡水湖泊里有記錄，而Lui Smiguel G A等[10]調(diào)查菲律賓最大淡水湖Laguna de Bay資源時(shí)也指出湖棲鰭蝦虎魚為該區(qū)域特有種。本研究采集的湖棲鰭蝦虎魚樣本表明鰭蝦虎魚屬在中國不僅存在一個(gè)物種。另外，《中國動(dòng)物志》指出鯔蝦虎魚屬的諸氏鯔蝦虎魚僅分布于香港而不產(chǎn)于臺(tái)灣。而Akihito記述該魚產(chǎn)于臺(tái)灣根據(jù)是的他人記錄，而非親自采集，持疑。筆者采集到諸氏鯔蝦虎魚11尾，表明該物種在中國雷州半島也有分布。

賀亮同學(xué)幫助采樣，張艷蘋等在數(shù)據(jù)處理及論文寫作給予指導(dǎo)，廣東海洋大學(xué)海洋生物技術(shù)研究室全體成員在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上給予幫助，謹(jǐn)致謝忱。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Sequence Variation and Molecular Phylogeny of Mitochondrial COI Gene Segments from Five Species of Gobiidae Family

LIAO Jian,ZHANG Shun,LONG Shui-sheng,HUANG Cheng-qin,GUO Yu-song,WANG Zhong-duo,LIU Chu-wu
（Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes,Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025,China）

Abstract:45 mitochondrial COI gene sequences of five kinds of goby juveniles from Mangroves of Leizhou region were obtained,and the average content of T,C,A,G were 29.9%,28.4%,23.9%,17.8%,respectively.A total of 23 haplotypes were found with 184 variable nucleotide positions,and the haplotype proportion of Tridentiger bifasciatus was the highest(80.0%),and that of Gobiopterus lacustris was the lowest(18.2%).The inter- and intra-specific genetic distances(Kimura two-parameter,K2P)ranged from 0.137 6 to 0.263 5,and 0.0000 to 0.020 8,respectively.Based on Neighbor-Joining and Maximum Likelihood phylogenetic tree,among the gobies clustered into five branches,Mugilogobius abei and M.chulae are in the closest relationship,while the relationship between Gobiopterus lacustris and the other four populations is a little far.The neutrality tests indicated that G.lacustris was dominated by moderate-frequency allelic loci,while there were a large number of low-frequency allelic loci within the other four populations.

通信作者：王中鐸（1980－），男，副教授。email:aduofa@gmail.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201996);廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（Yq2013089）;廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（Yq2013091）

收稿日期：2015-10-26

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.002

中圖分類號(hào)：Q754

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-9159（2016）01-0007-06

第一作者：廖?。?990－），男，碩士研究生，從事南海經(jīng)濟(jì)魚類發(fā)育生物學(xué)研究。email:liaojian05@outlook.com