張　英　　張　洪　　彭　銳　　魏丹蕓武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢　430060

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青蒿琥酯抑制肝星狀細(xì)胞m icroRNA-154/β-catenin治療肝纖維化的機(jī)制研究

張英張洪彭銳魏丹蕓
武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢430060

[摘要]目的探討青蒿琥酯抑制肝星狀細(xì)胞microRNA-154/β-catenin治療肝纖維化的機(jī)制。方法培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞，用不同濃度（0、5、10、20、30、40μg/mL）青蒿琥酯作用于大鼠肝星狀細(xì)胞，采用免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)青蒿琥酯作用后細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)青蒿琥酯作用后細(xì)胞內(nèi)的miR-154和β-cateninmRNA的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果0～40μg/mL青蒿琥酯作用細(xì)胞24 h后，免疫印跡法結(jié)果顯示，βcatenin蛋白量逐漸降低，并呈劑量相關(guān)性（P＜0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示青蒿琥酯作用后，β-catenin mRNA表達(dá)量及miR-154表達(dá)量逐漸降低，并呈劑量相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論青蒿琥酯可能是通過(guò)抑制microRNA-154表達(dá)作用于Wnt/β-catenin信號(hào)通路及來(lái)抑制肝纖維化的發(fā)生，microRNA-154與Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能存在一定的相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]青蒿琥酯曰肝星狀細(xì)胞曰miR-154曰W nt/β-catenin信號(hào)通路曰肝纖維化

肝纖維化是所有慢性肝病發(fā)展成肝硬化的共同病理基礎(chǔ)與必經(jīng)途徑，是“慢性肝炎-肝纖維化-肝癌”的中心環(huán)節(jié)，并且具有可逆性[1-2]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的主要發(fā)病機(jī)制，肝損傷后導(dǎo)致HSC大量活化增殖，從而合成分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），ECM的大量沉積導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[3]。因此促進(jìn)活化的HSC凋亡可能成為治療肝纖維化的有效方法。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是促肝纖維化細(xì)胞凋亡的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通路活化后，β-catenin移位至細(xì)胞核，與核內(nèi)T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）結(jié)合誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[4-5]。micoRNA（miRNA）是一類細(xì)胞內(nèi)源性小片段RNA分子，由20～25個(gè)核苷酸組成[6]。可以在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育等生命過(guò)程[7-8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了多種疾病的病理過(guò)程，是重要的疾病候選診斷標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)[9]。本課題組發(fā)現(xiàn)miR-154在大鼠HSC中表達(dá)具有較大程度的上調(diào)，抑制miR-154的表達(dá)可有效地促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

青蒿琥酯（Artesunate）是青蒿素的衍生物，前期研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡[10]，本實(shí)驗(yàn)深入探討了青蒿琥酯作用后HSC中Wnt/βcatenin信號(hào)通路中的蛋白表達(dá)含量及microRNA-154的表達(dá)量變化，研究?jī)烧咴诖龠M(jìn)HSC凋亡過(guò)程中的相關(guān)性。為探討青蒿琥酯抗肝纖維化的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株大鼠HSC（HSC-T6）購(gòu)于上海艾研生物有限公司，由美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)引進(jìn)，為SV40轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細(xì)胞，其表現(xiàn)型為活化的HSC細(xì)胞。

1.1.2試藥注射用青蒿琥酯（桂林南藥股份有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（上海吉諾公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibico公司）；胰蛋白-EDTA消化液（美國(guó)Gibico公司）；DMSO（美國(guó)Sigma公司）；96、6孔板（美國(guó)Corning公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（武漢谷歌生物有限公司）；β-catenin一抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；二抗羊抗兔IgG（美國(guó)LI-COR Biosciences公司）；RNA提取試劑Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.1.3儀器超凈工作臺(tái)（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司）；CB150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司）；HeraeusFresco21低溫微量離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）；NanoDrop 2000c紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；普通RT-PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；熒光定量PCR管（美國(guó)ABI公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取大鼠HSC（HSC-T6）用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）培養(yǎng)，于37℃、5%CO2飽和度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度大約為90%時(shí)，倒掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）平衡鹽溶液輕輕洗滌細(xì)胞

2次，棄去PBS，用0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞收縮變圓并開始滑落，立即加入培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打混懸細(xì)胞，1000 r/min離心5min，棄上清，用培養(yǎng)基將細(xì)胞吹散混懸，進(jìn)行傳代或種板。以3×105個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至60%～70%時(shí)，分別換成用含5、10、20、30、40μg/mL青蒿琥酯的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)一孔加等量不含藥培養(yǎng)基作為對(duì)照組，培養(yǎng)24 h后，提取蛋白質(zhì)和RNA。

1.2.2細(xì)胞總RNA的提取青蒿琥酯作用24 h后收集細(xì)胞，按照Trizol RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA。加入1mLTrizol反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，靜置15min，加入0.2mL氯仿（Trizol∶氯仿=5∶1），劇烈振蕩顛倒30 s，室溫靜置15min。4℃，12 000 r/min離心15min。移上清液至無(wú)酶離心管中，加入等體積異丙醇，靜置10min；4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1 mL預(yù)冷的75%乙醇，洗滌RNA。4℃下7500 r/min離心10min，重復(fù)1次。晾干至半透明，加入適量焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3免疫印跡法（Wes t ern b l ot）測(cè)定青蒿琥酯作用后細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)變化青蒿琥酯作用24 h后收集各孔細(xì)胞，PBS輕輕洗滌2次，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定提取的蛋白濃度。加上樣緩沖液，100℃加熱煮沸7min。每組取20μg總蛋白上樣，利用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各組細(xì)胞蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。PVDF膜用5%BSA封閉液封閉1h，用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，一抗β-catenin兔抗鼠（1∶500）和GAPDH兔抗鼠4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，加入羊抗兔二抗，室溫?fù)u床上慢速孵育1 h，TBST洗膜3次，利用Odyssey成像系統(tǒng)對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描分析，檢測(cè)各組細(xì)胞的β-catenin與GAPDH蛋白條帶的灰度值，計(jì)算兩者比值作為其相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.2.4Rea l-t ime PCR測(cè)定青蒿琥酯作用后細(xì)胞內(nèi)β-cat enin mRNA及miR-154表達(dá)變化取合格的RNA樣品，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mixture試劑盒檢測(cè)β-catenin mRNA、miR-154在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況。β-catenin mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miR-154以U6為反應(yīng)內(nèi)參，β-catenin、GAPDH、U6和miR-154的逆轉(zhuǎn)錄引物及RT-PCR反應(yīng)引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)條件為：95°C，30 s，1個(gè)循環(huán)；95°C，5 s，60°C，40 s，共40個(gè)循環(huán)；95°C，30 s，60°C，1min，95°C，15 s。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共包含20μL的反應(yīng)體系。反應(yīng)結(jié)束后得到各組的目的基因和內(nèi)參的Ct值，以內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用ΔΔCT法分析RT-PCR所得數(shù)據(jù)，根據(jù)公式2-ΔΔCT，（ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參，ΔΔCT=ΔCTArt組-ΔCT對(duì)照組），計(jì)算分別得到目的基因β-catenin和miR-154的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并做圖。

表1　RT-PCR中各引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，相對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定結(jié)果和蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果處理采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1青蒿琥酯對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響

與空白對(duì)照組比較，隨著青蒿琥酯藥物濃度的不斷升高，肝星狀細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)量逐漸降低，并呈劑量依賴性，β-catenin蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同濃度組之間β-catenin蛋白的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明青蒿琥酯作用于肝星狀細(xì)胞可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　青蒿琥酯對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞β-c a t e n i n蛋白的影響

2.2青蒿琥酯對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)β-catenin mRNA及m iR-154表達(dá)水平的影響

與空白對(duì)照組比較，隨著青蒿琥酯藥物濃度的不斷增加，肝星狀細(xì)胞內(nèi)β-cateninmRNA的表達(dá)量及miR-154的表達(dá)量逐漸降低，并呈劑量依賴性，βcateninmRNA及miR-154的表達(dá)量與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同濃度組之間的β-catenin mRNA及miR-154的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)圖2。說(shuō)明青蒿琥酯抑制肝星狀細(xì)胞的增殖可能與β-catenin及miR-154有關(guān)，miR-154與Wnt/β-catenin信號(hào)通路間可能存在一定相關(guān)性。

圖2　青蒿琥酯對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞β-c a t e n i n m RNA 及m iR-154表達(dá)的影響

3　討論

肝纖維化是指由各種致病因子所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程[11]。許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化，而肝纖維化是各種慢性疾病發(fā)展成肝硬化的中心環(huán)節(jié)，抑制肝纖維化的發(fā)生對(duì)預(yù)防肝硬化和肝癌的發(fā)生至關(guān)重要[12-13]。HSC是肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞，HSC被激活后大量增殖分化，在肝內(nèi)表達(dá)過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)，最終引起肝纖維化的發(fā)生[14]。因此抑制HSC的活化增殖是治療肝纖維化的有效方法。本實(shí)驗(yàn)前期用青蒿琥酯作用于大鼠HSC發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以有效地促進(jìn)HSC的凋亡[15]。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是近年來(lái)提出的促HSC凋亡的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[16]。該通路未活化時(shí)，β-catenin呈磷酸化狀態(tài)處于胞漿內(nèi)，該通路活化后，β-catenin去磷酸化并移位至細(xì)胞核內(nèi)，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子因子結(jié)合，誘導(dǎo)Wnt調(diào)控的靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。有研究報(bào)道稱抑制Wnt通路可以有效地促進(jìn)HSC的凋亡，抑制肝纖維化的發(fā)生[17-18]。

近年來(lái)，microRNA被發(fā)現(xiàn)參與許多疾病的病理過(guò)程，是疾病潛在的治療靶點(diǎn)和候選診斷標(biāo)志物[19]?？梢詫?duì)基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，影響細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育等多種生命活動(dòng)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-154在肺纖維化細(xì)胞中表達(dá)具有較大程度的上調(diào)，并且miR-154通過(guò)活化Wnt/βcatenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)肺纖維化細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生[21]。本研究前期發(fā)現(xiàn)，活化的大鼠HSC 中miR-154較普通大鼠肝細(xì)胞也有較大程度的上調(diào)，同時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大鼠HSC中處于活化狀態(tài)，說(shuō)明miR-154和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也可能起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用HSC后，細(xì)胞內(nèi)βcatenin蛋白含量及β-catenin mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，同時(shí)miR-154的表達(dá)量也明顯降低，并呈劑量依賴性，說(shuō)明青蒿琥酯促進(jìn)HSC的凋亡與Wnt/βcatenin信號(hào)通路及miR-154相關(guān)，可能是通過(guò)抑制miR-154對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控而發(fā)揮作用，抑制miR-154可以抑制其對(duì)β-catenin的活化作用，下調(diào)β-catenin介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)HSC的凋亡，抑制肝纖維化的發(fā)生。本研究結(jié)果提示miR-154及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在青蒿琥酯抑制肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的起著重要作用，但是miR-154與肝纖維化發(fā)生的關(guān)系、miR-154與β-catenin蛋白之間的關(guān)系及miR-154是否是通過(guò)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用來(lái)參與肝纖維化還有待我們進(jìn)一步研究。下一步我們將在大鼠HSC中轉(zhuǎn)染miR-154模擬物及抑制物，觀察其對(duì)大鼠HSC的增殖、凋亡的影響，觀察其對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從而確定miR-154在大鼠肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵作用，確定其可以作為治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。

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M echanism research on Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibitingm iR-154/茁-catenin in hepatic stellate cell

ZHANG Ying ZHANG Hong PENG Rui WEIDanyun
Department of Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

[Abstract]Objective To investigate themechanism of Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibitingmiR-154/β-catenin in hepatic stellate cell.M ethods HSC-T6 cells were cultured in vitro with different concentrations(0, 5,10,20,30,40μg/mL)of Artesunate on rat hepatic stellate cells.Western blotwas used to detect the expression of β-catenin protein after drug administration.RT-PCR was used to detect the expression ofβ-catenin mRNA and microRNA-154 after drug administration.Results After treatment with artesunate for 24 h,the results of Western blot showed that the expression ofβ-catenin protein significantly decreased in a dose-dependentmanner(P＜0.05).The results of RT-PCR showed that the expression ofβ-catenin mRNA and microRNA significantly decreased in a dosedependentmanner(P＜0.05).Conclusion Artesunatemay suppress the occurrence of liver fibrosis through inhibiting the expression ofmicroRNA-154 on Wnt/β-catenin signaling pathway.Theremay exist a certain correlation between miR-154 and the wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words]Artesunate;Hepatic stellate cell;miR-154;Wnt/β-catenin signaling pathway;Liver fibrosis

收稿日期：（2015-07-22本文編輯：趙魯楓）

[通訊作者]張洪（1962.5-），男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：靶向制劑研究，藥物作用機(jī)制研究，抗腫瘤藥物的新劑型及個(gè)體化給藥研究。

[作者簡(jiǎn)介]張英（1990.1-），女，武漢大學(xué)2013級(jí)藥劑學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：藥物作用機(jī)制研究。

[基金項(xiàng)目]湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011CDB491）。

[中圖分類號(hào)]R914.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-7210（2016）01（a）-0035-04