黎廣平　　陳大福▲　　劉寶岳.北京積水潭醫(yī)院北京市創(chuàng)傷骨科研究所，北京　00035；.北京積水潭醫(yī)院病理科，北京　00035

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急性期兔前交叉韌帶保殘重建的組織學(xué)研究

黎廣平1陳大福1▲劉寶岳2
1.北京積水潭醫(yī)院北京市創(chuàng)傷骨科研究所，北京100035；2.北京積水潭醫(yī)院病理科，北京100035

[摘要]目的應(yīng)用動物模型評估急性期保留殘端對兔前交叉韌帶（ACL）重建的組織學(xué)意義。方法選取20只成年健康的新西蘭兔，利用其一側(cè)后肢塑造急性期ACL斷裂模型，然后將所有動物隨機分為兩組，每組各10只。一組采用保留殘存腱束的方法重建ACL（保殘組）,另一組采用去除殘存腱束的方法重建ACL（去殘組）。所有動物統(tǒng)一采用自體半腱肌腱作為移植物，并在術(shù)后12周統(tǒng)一處死。首先利用肉眼對韌帶的宏觀狀態(tài)進行觀察，然后利用HE染色評估殘端與移植物愈合情況，并利用免疫組化染色評估移植物本體感受器及血運重建恢復(fù)情況。結(jié)果大體觀察結(jié)果顯示，所有ACL移植物連續(xù)性完整，張力滿意。HE染色評估顯示殘端及移植物未見明顯愈合跡象。免疫組化結(jié)果顯示兩組標(biāo)本移植物本體感受器數(shù)量（P=0.564）及新生血管數(shù)量（P=0.783）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論急性期保殘重建ACL未能顯著提高兔ACL重建的組織學(xué)性能。本研究中，組織學(xué)評估顯示ACL殘端與移植物間未能愈合，且兩組移植物中新生神經(jīng)本體感受器與新生血管數(shù)量未見顯著差異。因此，保留殘端重建ACL的組織學(xué)意義令人質(zhì)疑。

[關(guān)鍵詞]前交叉韌帶；保留殘端；組織學(xué)；兔

前交叉韌帶（anterior circulate ligament，ACL）重建的手術(shù)技術(shù)目前雖已成熟，但仍有文獻報道稱目前ACL損傷重建的失效率約為20%[1-4]。由此看來，該手術(shù)仍可被優(yōu)化。近年來，許多學(xué)者提出ACL損傷通常發(fā)生在其股骨止點附近，并在損傷后一段時間內(nèi)留有一定長度的殘端[5-7]。與此同時，相關(guān)的基礎(chǔ)研究也已證實：在ACL殘端內(nèi)部能夠觀察到血管及神經(jīng)本體感受器的存在[8-13]。因此，有學(xué)者提出，在傳統(tǒng)的韌帶重建基礎(chǔ)上保留這些殘端，有可能促進移植物的再血管化，進而改善患者術(shù)后膝關(guān)節(jié)本體感覺的恢復(fù)[6-7]。另一方面，也有研究顯示，ACL殘端內(nèi)部的血管及神經(jīng)本體感受器只能在ACL損傷后的急性期內(nèi)觀察到，其數(shù)量會隨著損傷時間的延長而下降[14]。由此，急性期保留殘端的理念又引起了學(xué)術(shù)界的關(guān)注?；仡櫦韧墨I發(fā)現(xiàn)，有關(guān)保留殘端ACL重建的相關(guān)研究主要呈現(xiàn)出以下兩方面的特點：①目前尚無臨床或基礎(chǔ)研究針對性評估ACL保殘術(shù)后移植物血運重建及神經(jīng)本體感覺的恢復(fù)情況；②大部分臨床研究皆為回顧性或非對照研究，保留殘端重建ACL的臨床依據(jù)尚不明確。因此，本研究塑造了ACL急性期損傷重建的動物模型，目的是利用動物模型評估急性期保留殘端對ACL重建術(shù)后移植物的組織學(xué)意義。

1　材料與方法

1.1實驗動物

采用成年健康新西蘭大白兔20只，體重3.0～3.8 kg，平均（3.5±0.1）kg。動物合格證號：SCXK（京）2011-0006。隨機分為兩組，每組各10只。一組行保留殘端ACL重建術(shù)（保殘組），另一組行去除殘端ACL重建術(shù)（去殘組）。所有手術(shù)均為單側(cè)ACL重建，手術(shù)側(cè)別隨機選擇，且統(tǒng)一采用自體半腱肌腱作為移植物。術(shù)后12周時將動物全部處死取材，對所取標(biāo)本分別行大體觀察及組織學(xué)評估。

1.2急性期ACL損傷模型的建立

所有動物均行單側(cè)ACL重建術(shù)，手術(shù)側(cè)別均在術(shù)前隨機決定。備皮完畢后，利用無菌繃帶包扎手術(shù)側(cè)足跟部，然后常規(guī)消毒，鋪單，麻醉。首先在髕骨內(nèi)側(cè)緣附近做一長4～5 cm縱行切口，使髕骨向外脫位，充分暴露正常ACL組織。然后緊貼ACL股骨止點利用手術(shù)刀將正常ACL組織切斷，并保留ACL實質(zhì)部及脛骨止點的完整性。至此，急性期ACL損傷模型建立完畢。

1.3手術(shù)方法

本研究所采用的保留殘存腱束的手術(shù)方法與宋關(guān)陽等[15]的手術(shù)方法相同，具體步驟描述如下：

1.3.1保殘組處理ACL殘端：利用4-0不可吸收的滌綸線在殘存腱束的股骨末端滑膜完整處縫合3～4針，用以牽拉腱束組織。

制備脛骨隧道：脛骨隧道利用直徑2.0 mm克氏針鉆取。為了不破壞殘端組織，隧道中心點定位于ACL殘端脛骨止點后方約1.0mm處，采用由內(nèi)向外的方法鉆取脛骨隧道。

制備股骨隧道：利用另外一根2.0mm的克氏針制備股骨隧道。隧道中心點位于ACL股骨足印區(qū)的中心點，同樣采用由內(nèi)向外的方法鉆取。

獲取與制備移植物：本研究從手術(shù)側(cè)獲取自體半腱肌腱移植物。接下來，使用4-0滌綸線編織縫合移植物兩端，并分別測量其長度及直徑。

固定移植物及殘端：在導(dǎo)針的牽引下，先將移植物從脛骨隧道引入，再將其與殘端牽引線同時引入股骨隧道。隨后利用Endobutton裝置固定股骨側(cè)，固定時施以一定張力，使移植物及ACL殘端均能進入股骨隧道。然后利用Endobutton裝置固定移植物脛骨側(cè)。最后在關(guān)節(jié)內(nèi)靠近股骨隧道內(nèi)口處將殘端與移植物利用可吸收縫線縫合一針，以促進二者纖維之間的相互長入。

1.3.2去殘組對于去殘組動物，則采用相同的方法制備股骨隧道。在制備脛骨隧道時，先將ACL殘端完全去除，然后充分顯露其脛骨足印區(qū)，并選擇足印區(qū)中心點鉆取脛骨隧道。最終同樣采用Endobutton固定移植物兩端。術(shù)后所有動物統(tǒng)一籠養(yǎng)，自由活動。

1.4標(biāo)本制備

術(shù)后12周，將所有動物統(tǒng)一處死，取動物的雙側(cè)下肢（從髖關(guān)節(jié)處離斷）。然后小心去除膝關(guān)節(jié)囊周圍的肌肉及軟組織，并將標(biāo)本用生理鹽水紗布包扎，在-4℃條件下冷凍，在實驗前1 d將標(biāo)本置于4℃環(huán)境中解凍。

1.5大體觀察

首先觀察手術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)大體形態(tài)，包括關(guān)節(jié)活動度（range ofmotion，ROM）、關(guān)節(jié)感染狀況以及關(guān)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)（包括關(guān)節(jié)軟骨、雙側(cè)半月板），然后觀察移植物連續(xù)性及其張力（每組各10個）。

1.6組織學(xué)評估

取每組標(biāo)本分別進行HE染色及免疫組化染色評估。首先切斷除ACL移植物及殘端組織以外的所有韌帶，并去除雙側(cè)半月板及膝關(guān)節(jié)周圍軟組織。然后以膝關(guān)節(jié)為中心，分別在股骨近端及脛骨遠端1 cm處將標(biāo)本橫斷，得到股骨-移植物/殘端-脛骨復(fù)合體，并在室溫條件下將復(fù)合體置于4%福爾馬林固定液中固定48 h。接下來先后經(jīng)過脫鈣、沖洗和石蠟包埋三步處理方法將標(biāo)本完全包埋于蠟塊之中，并在切片機上沿移植物/殘端走行方向以4μm為厚度進行切片。每個標(biāo)本連續(xù)切片共5張，最終采用HE染色方法對標(biāo)本進行組織學(xué)評估。評估內(nèi)容包括兩個方面：①移植物的腱骨愈合狀況；②ACL殘端與移植物之間的愈合情況。

然后分別利用兩種單克隆一抗血管內(nèi)皮生長因子（endothelial vascular growth factor，VEGF）與神經(jīng)纖絲（Neurofilament，NF）兩種第一抗體進行染色，然后經(jīng)過相關(guān)洗滌及抗原孵化過程后，利用相應(yīng)第二抗體進行染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，對每個標(biāo)本的每個層面隨機抽取5個感興趣區(qū)域，并利用光學(xué)處理軟件Image-Pro Plus統(tǒng)計最終的陽性結(jié)果數(shù)量.

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用X2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組動物的術(shù)前相關(guān)數(shù)據(jù)比較

術(shù)前保殘組與去殘組的動物質(zhì)量、移植物長度及橫截面直徑的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1　兩組動物的術(shù)前相關(guān)數(shù)據(jù)比較（±s）

表1　兩組動物的術(shù)前相關(guān)數(shù)據(jù)比較（±s）

組別　動物數(shù)　　體重（kg）自體肌腱長度（cm）自體肌腱橫截面直徑（mm）保殘組去殘組P值10 10 3.54±0.23 3.63±0.29 0.853 1.65±0.04 1.67±0.07 0.674 1.64±0.05 1.66±0.08 0.268

2.2術(shù)后大體觀察

術(shù)后12周行大體觀察時，保殘組與去殘組標(biāo)本ROM與正常側(cè)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，所有手術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)明顯骨關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)，且雙側(cè)半月板均未見撕裂，所有ACL移植物均具有完整的連續(xù)性及滿意的張力。見圖1。

2.3術(shù)后組織學(xué)評估

保殘組與去殘組標(biāo)本經(jīng)HE染色后顯微鏡下觀察顯示移植物脛骨側(cè)和股骨側(cè)兩端隧道內(nèi)部腱骨愈合情況良好，且移植物內(nèi)部纖維細胞呈均勻縱行排列。進一步觀察保殘組標(biāo)本ACL殘端與移植物愈合情況時，可見殘端組織與移植物之間在脛骨側(cè)、韌帶實質(zhì)部與股骨側(cè)均存在明顯間隙，并未發(fā)現(xiàn)任何纖維融合表現(xiàn)，由此可見殘端與移植物間并未出現(xiàn)顯著愈合跡象。見圖2。

兩組標(biāo)本免疫組化染色結(jié)果顯示ACL移植物內(nèi)部VEGF陽性新生血管數(shù)量與NF新生陽性本體感受器數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3～4、表2。

圖3　兩組血管內(nèi)皮生長因子陽性血管數(shù)量（1 0 0×）

圖4　神經(jīng)纖絲陽性本體感受器數(shù)量鏡下圖像（1 0 0×）

表2　兩組術(shù)后血管內(nèi)皮生長因子陽性血管及神經(jīng)纖絲陽性本體感受器數(shù)量（±s）

表2　兩組術(shù)后血管內(nèi)皮生長因子陽性血管及神經(jīng)纖絲陽性本體感受器數(shù)量（±s）

組別　　動物數(shù)　血管內(nèi)皮生長因子陽性血管數(shù)量神經(jīng)纖絲陽性本體感受器數(shù)量保殘組去殘組P值10 10 28.3±4.2 27.6±5.1 0.564 30.5±5.3 29.8±6.4 0.783

3　討論

本研究最主要的發(fā)現(xiàn)：急性期保留殘端技術(shù)相比去除殘端重建ACL技術(shù)未能顯著改善ACL移植物的血運重建及神經(jīng)本體感覺的恢復(fù)狀況。

回顧既往文獻發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于保殘重建ACL是否能夠顯著提高術(shù)后膝關(guān)節(jié)本體感覺在學(xué)術(shù)界尚存爭議。雖然Ahn等[13]的結(jié)果顯示保殘重建ACL術(shù)后2年患者的膝關(guān)節(jié)本體感覺恢復(fù)良好，但Hong等[7]最近的隨機對照研究則顯示保殘組患者與去殘組相比其術(shù)后2年膝關(guān)節(jié)本體感覺并沒有顯著性差異。本研究組認為，保留殘端技術(shù)究竟能否明顯改善術(shù)后膝關(guān)節(jié)本體感覺，應(yīng)首先基于殘端組織是否能夠和移植物愈合成為一體。另一方面，也有一些作者提倡急性期保留殘端重建ACL的理念[14-16]。Denti等[14]發(fā)現(xiàn)ACL完全斷裂后，其殘端內(nèi)部的本體感受器會隨著損傷時間的延長而下降；Ahn等[5]利用核磁影像評估保殘術(shù)后患者的殘端愈合情況時也發(fā)現(xiàn)，凡是受傷到手術(shù)時間越短的患者，其保殘術(shù)后殘端與移植物的愈合情況越滿意。因此，本研究所有保殘手術(shù)均在ACL損傷的急性期進行，希望能夠顯著提高殘端存活率以及改善與移植物的愈合效果。

然而，本研究通過對殘端HE染色的進一步觀察發(fā)現(xiàn)：殘端組織與移植物之間仍存明顯間隙，二者并未出現(xiàn)愈合跡象。該結(jié)果與既往研究結(jié)果似乎有顯著不同：Ahn等[5]利用核磁評估保殘術(shù)后殘端與移植物間的愈合情況，結(jié)果顯示85%的患者其殘端信號已難與移植物區(qū)分；而之后的二次關(guān)節(jié)鏡探查[15]也顯示有82%的患者殘端與移植物愈合狀況滿意。但核磁本身并不能作為評價殘端愈合情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而且Ahn 等[5]的二次關(guān)節(jié)鏡探查只能稱之為大體觀察，并未針對殘端的愈合狀況做進一步評估。

基于此，本研究利用組織學(xué)切片的方法進一步評估殘端與移植物之間的愈合情況，結(jié)果顯示ACL殘端組織與移植物間仍然存在顯著間隙。一方面，組織學(xué)染色相比核磁評估與二次關(guān)節(jié)鏡探查而言，評估方法更為準(zhǔn)確可靠，可以作為目前評估殘端組織與移植物愈合情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”；另一方面，本研究首先應(yīng)用病理學(xué)方法評估殘端組織的愈合效果，可以為今后的相關(guān)研究提供一定的參考價值。

本研究存在如下幾個方面的不足：①本研究為動物實驗，從動物研究中獲得的數(shù)據(jù)并不能直接應(yīng)用于臨床；②動物與人的ACL術(shù)后恢復(fù)周期存在較大差異，本研究組之所以選擇12周作為實驗終末點，是因為已有文獻報道[17-18]術(shù)后12周兔ACL的腱骨愈合程度已趨于成熟。

急性期保殘重建ACL未能顯著提高兔ACL重建的組織學(xué)性能。本研究中，組織學(xué)評估顯示ACL殘端與移植物間未能愈合，且兩組移植物中新生神經(jīng)本體感受器與新生血管數(shù)量未見顯著差異。因此，保留殘端重建ACL的組織學(xué)意義令人質(zhì)疑。

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Histological study of acute anterior cruciate ligament reconstruction w ith remnant preservation in rabbits

LIGuangping1CHEN Dafu1▲LIU Baoyue2
1.Beijing Institute of Traumatology&Orthopaedics,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China;2.Department of Pathology,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China

[Abstract]Objective To evaluate the potential histological benefits after the acute remnant-preserving anterior cruciate ligament(ACL)reconstruction in rabbitmodel.M ethods 20mature female New Zealand white rabbitswere selected for acute ACL femoral detachmentmodel in one of the hind limbs,they were randomly divided into two groups,with 10 rabbits in each group.Remnant-preserving group were treated with remnant-preserving ACL reconstruction,conventional remnant group were treated with conventional ACL reconstruction.All the surgeries used the semitendinosus tendon autografts,and all the animals were sacrificed at 12 weeks after surgery for macroscopic observations.The remnant-to-graft healing capacity was evaluated using HE stainingmethod,the immonuhistochemical staining was used to assess the reinnervation and revascularity of the ACL grafts between groups.Results Macroscopic observations revealed that all the ACL graftsmaintained adequate continuity and tension.Histological evaluations showed that satisfied tendon-to-bone healing results in each specimen.However,none of the specimen showed a remnant-to-graft healing results.Moreover,the reinnervation(P=0.564)and revascularity(P=0.783)of ACL grafts still showed no statistically significant differences between two groups.Conclusion The acute remnant-preserving ACL reconstruction fail to significantly improve the histological properties compared with the conventional ACL reconstruction.In this study,no remnant-to-graft healing capacity shows on HE staining and no significant differences detecte between groups in terms of reinnervation and revascularity of the ACL grafts.The histological benefit of remnant-preserving ACL reconstruction is therefore questioned.

[Key words]Anterior cruciate ligament;Remnant preservation;Histological;Rabbits

收稿日期：（2015-07-30本文編輯：蘇暢）

通訊作者▲

[中圖分類號]R318.01

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0030-05