孫麗霞　　劉大偉　　劉　芳　　范新娟　　趙國強▲.中山大學附屬江門市中心醫(yī)院病理科，廣東江門　59030；.中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州　50080

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微囊化肝細胞移植代償肝功能的實驗研究

孫麗霞1劉大偉2劉芳2范新娟2趙國強2▲
1.中山大學附屬江門市中心醫(yī)院病理科，廣東江門529030；2.中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州510080

[摘要]目的探討微囊化肝細胞移植對肝臟功能的代償能力。方法以D-氨基半乳糖胺（D-gal）作為肝臟毒劑，構建SD大鼠急性肝功能衰竭模型。通過腹腔移植分別植入微囊化肝細胞和游離肝細胞。結合谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）多項血生化指標以及模型動物生存率比較，評估植入細胞對肝功能衰竭的代償能力。結果細胞植入后12 h開始對模型動物的肝生化指標ALT、AST、TBIL、ALB產(chǎn)生影響，其影響力在細胞植入后24～48 h達到高峰。對比游離肝細胞，微囊化肝細胞移植對各項肝生化指標的改善尤為明顯，且動物的存活率最高。結論微囊化肝細胞腹腔內(nèi)移植有助于提高藥物誘導急性肝功能衰竭大鼠的存活率，可明顯改善急性肝功能衰竭模型大鼠的肝功能。

[關鍵詞]肝細胞；微囊化；移植；肝衰竭

由各種急性肝損害引起的急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）嚴重危及人類生命。臨床上肝功能重建的途徑主要有同位肝移植、生物人工肝技術以及肝細胞移植。肝細胞移植技術前景十分誘人，但因細胞來源復雜，宿主對移植物的免疫排斥反應等問題遭遇發(fā)展瓶頸。微囊化包裹肝細胞技術為肝細胞大規(guī)模及高活性體外培養(yǎng)提供了新的途徑。本實驗采用D-氨基半乳糖誘導大鼠急性肝衰竭模型，經(jīng)腹腔內(nèi)移植微囊化的大鼠肝細胞，通過觀察分析模型動物肝臟多項生化指標的變化特征、肝組織的病理學變化以及模型動物的存活率，評估植入細胞對肝功能衰竭的代償能力。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

無菌超凈臺（蘇州超凈儀器設備廠）、細胞培養(yǎng)箱（Precision，美國）、細胞培養(yǎng)瓶（Corning美國）、倒置相差顯微鏡、冷場發(fā)射掃描電鏡（日本電子株式會社，由中山大學測試中心提供）、全自動生化分析儀（日本日立7170型）、JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海電磁新涇儀器有限公司）、VORTEX-GENIE2振蕩器（Scienlific Industries）、微囊制備儀（自制）、D-氨基半乳糖胺（江蘇啟東九豐工貿(mào)有限公司）、DMEM/F12干粉（美國Gibico公司）、海藻酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）、殼聚糖（浙江澳興生物技術有限公司）。

1.2方法

1.2.1動物清潔級雌性SD大鼠34只，6周齡，體重130～150 g，由中山大學實驗動物中心提供。標準鼠食，自由飲水，飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2.2肝細胞來源及細胞計數(shù)正常大鼠肝細胞株BRL，由中山大學實驗動物中心提供。將生長狀態(tài)良好的BRL肝細胞株用0.25%胰蛋白酶消化，采用4%臺盼藍染色鑒定細胞活性，細胞計數(shù)板計算細胞數(shù)目，細胞活力98%以上方可用于實驗。

1.2.3微囊化肝細胞的制備將2%海藻酸鈉/肝細胞混懸液加入自制微囊發(fā)生裝置（圖1），用毛細管破碎法得到微囊化肝細胞，微囊呈圓形，形狀較規(guī)則、大小較均一，平均直徑約0.7mm。

圖1　毛細管破碎法實驗裝置

1.2.4急性肝功能衰竭模型的建立及動物分組將實驗所用34只SD大鼠禁食12 h后，以造成肝功能衰竭病變的最佳劑量D-氨基半乳糖胺（D-gal）1.4 g/kg一次性腹腔注射構建大鼠急性肝功能衰竭模型。實驗動物隨機分為三組：①微囊組（9只）：造模成功后12 h經(jīng)腹腔移植微囊化正常鼠肝細胞株BRL。②游離組（10只）：造模成功后12 h經(jīng)腹腔移植游離正常鼠肝細胞株BRL。③對照組（15只）：造模成功后12 h經(jīng)腹腔移植空白對照PBS溶液。

1.2.5觀察與檢測指標各組急性肝功能衰竭SD大鼠在腹腔注射D-gal前一刻開始采第1次血，作為正常對照，以后采血時間分別為造模后12、24、48、96、168 h，均剪尾取血，每次約1.5 mL，采用全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）4項指標，并觀察計算各組大鼠7 d存活率。

1.2.6肝臟組織學變化收集各組動物造模后24 h的肝組織標本，10%甲醛固定，HE染色，光鏡觀察組織變化情況。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1急性肝功能衰竭大鼠模型的生物學特征

2.1.1一般狀態(tài)的觀察造模成功后，大鼠于12 h出現(xiàn)活動明顯減少、萎靡、嗜睡，痛覺反應遲鈍或消失等現(xiàn)象，24 h可發(fā)展至昏睡狀態(tài)，此時動物開始出現(xiàn)死亡，在24～96 h內(nèi)動物陸續(xù)死亡12只，96 h后大鼠一般狀態(tài)有所好轉。

2.1.2肝功能生化指標的變化大鼠腹腔注入D-gal后，AST、ALT、TBIL逐漸升高，12 h時已出現(xiàn)明顯變化，并于24 h達到異常最高點，之后緩慢下降，48 h時有明顯改善，進一步恢復于168 h接近正常水平；ALB則逐漸下降，12 h時出現(xiàn)明顯異常，并于24 h時達到最低點，48 h時ALB數(shù)值逐漸回升，在168 h時恢復至接近正常狀態(tài)。見表1。

2.1.3模型大鼠肝臟組織病理學特征在D-gal誘導24 h時肝臟病理改變最為明顯，肝臟表面淤血嚴重，質(zhì)地較軟，肝臟組織經(jīng)HE染色后，鏡下觀察可見肝小葉結構破壞，肝細胞呈片狀壞死，肝竇擴張，充血、出血明顯，匯管區(qū)及壞死區(qū)可見炎癥細胞浸潤。168 h時肝臟充血消退，表面可見大小不一的結節(jié)，鏡下觀察可見假小葉形成，另有少量肝細胞脂肪變性（圖2）。

圖2　D-g a l腹腔注射誘導模型大鼠肝臟組織學形態(tài)（HE，1 0 0×）

2.2微囊的形態(tài)特征

2.2.1光鏡形態(tài)倒置相差顯微鏡下觀察，微囊呈圓形，形狀較規(guī)則、大小較均一，平均直徑約0.7mm；微囊表面光滑，囊壁透明完整，透過囊壁可見微囊內(nèi)散在分布均勻的細胞（圖3）。

2.2.2掃描電鏡低分子量殼聚糖外膜的微囊500倍下可見表面粗糙伴有不等球形隆起；5000倍下可見粗糙表面由粗糙大顆粒組成；50 000～100 000倍下可見每個大顆粒表面由分布均勻且形狀大小均一的珊瑚狀結構組成，珊瑚狀結構之間存在一定的空隙（圖4）。

2.3各移植組大鼠的血清學變化

各移植組肝功能在D-gal 1.4 g/kg注射12 h時均已顯著異常，此時進行細胞移植。移植后微囊組與游離組較對照組的肝生化指標均有明顯改善，但微囊組大鼠的AST、ALT、TBIL逐漸升高，且升高幅度較小，于48 h出現(xiàn)小高峰，游離組大鼠的AST、ALT、TBIL 于24 h異常達到最高峰，之后逐漸下降，于48 h有明顯改善，肝功能進一步恢復于168 h時接近正常狀態(tài)。微囊組大鼠的ALB在細胞移植后未見明顯下降，游離組大鼠的ALB逐漸下降，并于24 h達到最低點。見表1。各移植組肝生化指標動態(tài)曲線見圖5。

圖3　載細胞微囊（倒置相差顯微鏡，4 0×）

圖4　微囊表面珊瑚狀結構

表1　三組大鼠肝功能變化（±s）

表1　三組大鼠肝功能變化（±s）

注：與游離組同時間比較，*P＜0.05；ALT：谷丙轉氨酶；AST：谷草轉氨酶；ALB：白蛋白；TBIL：總膽紅素

組別　0 h　12 h　24 h　48 h　96 h　168 h對照組AST（U/L）ALT（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）游離組AST（U/L）ALT（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）微囊組AST（U/L）ALT（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）80.60±9.85 47.30±8.97 0.21±0.07 39.80±3.46 501.20±23.45 398.74±17.25 2.89±0.11 35.50±4.36 2448.13±2892.30 2240.95±2801.45 12.82±2.88 20.43±1.43 79.30±8.35 53.20±5.69 0.09±0.02 40.50±3.96 500.90±25.60 403.50±20.63 2.57±0.13 36.93±2.67 1378.56±2437.54 1759.76±3601.48 5.22±0.94 30.50±1.44 546.33±41.77 564.40±22.42 1.60±0.20 35.87±2.93 90.80±2.92 48.33±7.01 0.34±0.40 37.43±0.57 2016.83±1043.25 2097.41±721.21 9.26±1.77 30.66±2.82 80.40±7.94 47.20±9.63 0.45±0.02 42.10±2.53 499.70±23.72 409.63±10.75 2.99±0.09 35.95±5.25 536.45±424.31 336.45±451.84 4.05±0.97 31.70±2.22 218.62±25.31 91.60±11.20 0.45±0.23 36.33±0.76 80.20±1.78 53.24±7.77 0.17±0.10 40.22±2.69 625.11±338.07*943.74±121.06*4.18±1.18*37.03±2.41*1380.71±357.80 929.54±2209.71*4.96±0.62 36.77±1.64*191.38±10.16 44.65±4.70 0.32±0.26 35.88±2.15*85.80±6.91 47.94±14.60 0.51±0.27 41.29±3.41

圖5　細胞移植后各組肝生化指標水平（AST、ALT、TB I L、ALB）的變化

2.4各移植組肝臟形態(tài)學變化

細胞移植后12 h，微囊組大鼠較游離組大鼠的肝臟有明顯改善，鏡下表現(xiàn)為肝竇輕度擴張，肝細胞輕度空泡變性，而游離組動物肝臟則表現(xiàn)為肝細胞索結構紊亂，肝細胞大片壞死并空泡變性，血管充血出血明顯（圖6）。168 h時各組動物肝臟均可見假小葉形成，假小葉內(nèi)肝細胞基本正常。

圖6　細胞移植后1 2 h肝臟組織學形態(tài)（HE，1 0 0×）

2.5各移植組大鼠存活率統(tǒng)計

7 d存活率分別為微囊組77.8%（7/9），游離組50.0%（5/10），對照組20.0%（3/15），微囊組大鼠的生存率明顯高于其他兩組。

3　討論

肝細胞移植已成為繼原位肝移植后又一治療肝衰竭和肝先天性代謝疾病的有效治療措施，它可以提供急性肝功能損害時的代謝支持，或者替代受者的肝細胞功能，使急性肝衰竭患者的受損肝細胞再生得到足夠支持的肝功能或使患者渡過急性肝衰的難關，從而為原位肝移植贏得時間，同時也是一種過渡性治療手段，作為等待供肝患者維持生命的橋梁。但同種異體或異種肝細胞移植又不可避免地發(fā)生免疫排斥反應而影響細胞移植的成功率。

微囊是用親水性高分子材料與細胞混勻，從噴嘴射出時在組織細胞簇表面成型，形成直徑50～800μm包裹組織細胞的球囊[1]。而細胞微囊化是采用無毒高分子聚合物膜材料包裹細胞，形成直徑數(shù)十至數(shù)百微米微囊的技術[2]。微囊制備技術已廣泛應用于糖尿病、帕金森癥、鎮(zhèn)痛、腫瘤等疾病治療過程中[3-7]。

將肝細胞用具有選擇性的半透膜包裹或隔離，細胞生存所必需的營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物及生物活性物質(zhì)等能通過半透膜自由出入，而宿主免疫細胞、免疫球蛋白等大分子物質(zhì)則不能通過[8-10]。因此，囊內(nèi)肝細胞可不受宿主的免疫排斥而正常存活，發(fā)揮其生物學功能。微囊具有體積小、制作方法簡單等優(yōu)點，并且膜內(nèi)細胞的自由空間可控制[11]，微囊還可提供細胞附著的基質(zhì)，使肝細胞之間相互接觸，并形成一種三維結構[12]，微囊的這種三維結構通過改善細胞間的相互作用，在維持肝功能方面起重要作用。

隨著微囊化人工細胞技術研究的不斷深入，各種制作工藝也日趨完善。在本實驗中，筆者選用了容易控制、設備簡單和經(jīng)濟的毛細管破碎制囊體系，其原理為當海藻酸鈉/細胞混懸液經(jīng)毛細管流出時，在高頻振蕩器的作用下克服表面張力，迅速破碎為大小較均勻一致的微球形液滴，然后在重力作用下垂直落入氯化鈣溶液中，并迅速凝固成海藻酸鈣微球。成囊裝置主要由高頻振蕩器、磁力攪拌器組成，可以通過改變振蕩針孔徑、振蕩頻率和流速來控制微球的直徑。

海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉（APA）微囊具有良好的生物相容性和機械強度，是當前發(fā)展最廣泛、最成熟的技術[13-15]，但聚賴氨酸是人工合成的陽離子聚合物，價格昂貴，難以實現(xiàn)其廣泛應用。相比之下，殼聚糖是天然的高分子物質(zhì)，具有優(yōu)異的生物相容性[16]，價格便宜，無免疫原性，在醫(yī)療領域有著廣泛的應用前景，是制作微囊的理想材料[17]。Marcotte等[18]研究發(fā)現(xiàn)：殼聚糖相對分子質(zhì)量對微囊的強度和控釋性的影響是很重要的。有研究采用亞硝酸鹽氧化法制備了不同分子質(zhì)量的殼聚糖，發(fā)現(xiàn)高分子質(zhì)量殼聚糖制備的微囊膜薄接近透明，微囊十分脆弱，若懸浮液提供的浮力消失，微囊很容易在自身重力作用下破碎[19]；另一方面通過降低殼聚糖分子質(zhì)量形成的微囊膜厚、彈性強，球形圓整，囊邊緣光滑不變形。King等[20]也發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖相對分子質(zhì)量的降低，制備的微膠囊強度提高。本實驗中選用的是低分子量殼聚糖，制備的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉（ACA）微囊能為囊內(nèi)細胞生長提供良好的微環(huán)境，且具有較好的生物相容性和物理穩(wěn)定性。

本實驗應用微囊化技術將BRL細胞通過腹腔移植于D-gal誘發(fā)的急性肝功能衰竭大鼠模型中，微囊組與游離組比較，24 h各項生化指標均有顯著差異（P＜0.05），48 h生化指標AST、ALB有顯著差異（P＜0.05），96 h ALB指標有顯著差異（P＜0.05）。由此可以看出，微囊化肝細胞移植顯著改善了急性肝功能衰竭模型大鼠的AST、ALT、TBIL、ALB等生化指標，并提高了動物生存率，肝組織形態(tài)學也顯示微囊組較游離組的肝臟病理變化有明顯改善。

綜上所述，利用自制微囊制備儀制備的ACA微囊具有良好的通透性，肝細胞所分泌的小分子生物活性物質(zhì)、ALB等可透過微囊發(fā)揮肝細胞的功能，起到一定的肝功能代償作用。肝細胞微囊化技術具有廣泛的應用前景，但微囊易于破碎及存活時間短等問題有待進一步研究。

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Experimental com pensatory ability of hepatic failure by transp lantation of m icroencapsulated hepatocytes

SUN Lixia1LIU Dawei2LIU Fang2FAN Xinjuan2ZHAOGuoqiang2▲
1.Department of Pathology,Jiangmen Central Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University,Guangdong Province, Jiangmen 529030,China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangdong Province,Guangzhou 510080,China

[Abstract]Objective To investigate the compensatory ability ofmicroencapsulated hepatocyte transplantation on acute hepatic failure rats.M ethods An acute hepatic failure ratmodelwas induced by celiac injection of D-gal.Microencapsulated and non-microencapsulated rat hepatocytes BRL were transplanted into acute hepatic failuremodel rat by abdominal cavity administration,respectively.The blood levels of ALT,AST,TBIL,ALB as well as survival rate of host rats were comparably analyzed to evaluate the compensatory ability ofmicroencapsulated hepatocytes for the prostrate liver.Results Levels of ALT,AST,TBIL and ALB were influenced in acute hepatic failure ratmodel at 12 h after transplantation,and peaked between 24-48 h.Compared with the non-microencapsulated cell,the level of liver biochemical index improved obviously and the survival rate was the highest inmicroencapsulated hepatocytes.Conclusion After microencapsulated hepatocyte transplantation,the survival rate of acute liver failure rats induced by D-gal increased and the liver function improved obviously.

[Key words]Hepatocyte;Microencapsulated;Transplantation;Hepatic failure

收稿日期：（2015-10-10本文編輯：程銘）

通訊作者▲

[作者簡介]孫麗霞（1982.8-），女，碩士研究生；研究方向：分子病理與腫瘤病理。

[基金項目]國家自然科學基金資助項目（30170473）；廣東省自然科學基金資助項目（04009326）。

[中圖分類號]R318

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0004-05