張 威，馬賢德，田維柱

(1．遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，沈陽 110847;2．遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

眼針八區(qū)八穴對腦缺血再灌注24 h大鼠海馬組織中MAPK信號傳導通路的影響*

張 威1，馬賢德2，田維柱△

(1．遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，沈陽 110847;2．遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

目的:觀察八區(qū)八穴取穴眼針療法對腦缺血再灌注損傷模型大鼠海馬組織中p38MAPK、ERK1/2、JNK表達水平的影響，探討八區(qū)八穴取穴眼針療法治療缺血性腦病的部分機制。方法:健康SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(280±20)g。按體質(zhì)量隨機分組，分為空白對照組(8只)、假手術(shù)組(8只)和模型復制組(24只)。對模型復制組24只大鼠采用線栓法進行模型復制，模型評價后，篩選模型合格的大鼠進行亞組劃分，分別為模型對照組、眼針對照組，即分為正常組、假手術(shù)組、模型組、眼針組4組。眼針組大鼠給予眼針干預，再灌注即刻以及之后的每8 h進行1次針刺治療，至再灌注24 h取材進行相關指標檢測。采用免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達水平。結(jié)果:與空白對照組比較，模型對照組和眼針組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表達水平均顯著升高;與模型對照組比較，眼針組大鼠腦組織中P38MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表達水平顯著下降。結(jié)論:眼針可能通過抑制p38-MAPK信號傳導通路而發(fā)揮其腦保護作用。

八區(qū)八穴;腦缺血再灌注;眼針;p38MAPK;JNK;ERK．

腦中風病根據(jù)其病因不同分為缺血性中風和出血性中風。缺血性中風主要是因為腦血管的狹窄或堵塞而引發(fā)的1組以腦缺血、缺氧為主要癥狀的疾病。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，缺血性腦病的發(fā)病率日益增高。另外，缺血性中風的高致死率、致殘率等原因，使人們對該疾病的防治逐年受到重視。

眼針療法是彭靜山教授于20世紀70年代首創(chuàng)，應用臨床治療缺血性腦病幾十年。后人在應用彭靜山眼針療法的同時，繼續(xù)對該方法逐步進行改善，先后在針刺器具及選穴等方面進行了方案的優(yōu)化。八區(qū)八穴取穴方法由田維柱教授提出，該方法取穴更簡單，更易定位，克服了以往因眼周區(qū)域小而帶來的取穴難以精確的缺點。臨床療效顯示，八區(qū)八穴取穴方法與原八區(qū)十三穴取穴方法的療效并無明顯差異。

本研究擬采用八區(qū)八穴取穴方法對腦缺血再灌注模型大鼠進行眼針療法干預，并對海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達水平進行檢測，觀察各組間蛋白表達水平的差異，探討八區(qū)八穴取穴法對腦缺血再灌注損傷的部分作用機制，為臨床八區(qū)八穴取穴法的推廣提供實驗依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(280± 20)g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實驗用大鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司(動物許可證編號SCXK(遼)2010-0001)。大鼠購入后，于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級實驗動物室內(nèi)適應性飼養(yǎng)1周，然后進行實驗。實驗期間，給予大鼠常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，隔日更換墊料，自由飲水，室溫(20±2)℃，相對濕度45%。實驗設計及實施過程中嚴格遵循動物實驗的3R原則［1］。

1.2 設備及器材

1.2.1 儀器設備 37℃恒溫水浴鍋，常州國華儀器制造廠(SHA-B型)。

1.2.2 手術(shù)器材 手術(shù)器械、縫合針線及手術(shù)敷料由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心手術(shù)室統(tǒng)一提供。釣魚線購自漁具店，直徑為0.25 mm，使用前裁剪成5 cm，一端用細砂紙打磨成半球形，用黑色油性記號筆在距離半球形端1 cm、1.8 cm、2.2 cm處做3個標記備用。

1.3 實驗試劑

兔抗大鼠P38MAPK、ERK1/2、JNK抗體購自abcam公司，免疫組織化學SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組

健康SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(280± 20)g。按體質(zhì)量隨機分為空白對照組(8只)、假手術(shù)組(8只)和模型復制組(24只)。對模型復制組24只大鼠進行模型復制，模型評價后篩選模型合格的大鼠進行亞組劃分(實際剩余18只)，分別為模型對照組(計劃12只，實際9只)、眼針對照組(計劃12只，實際9只)，即分為正常組、假手術(shù)組、模型組、眼針組4組。

2.2 模型復制

MCAO模型復制參照李玉芳等研究方法［2］，對模型復制組的24只大鼠采用改良線栓法復制腦缺血再灌注損傷大鼠模型。假手術(shù)組術(shù)式同模型復制組，但插入釣魚線的深度僅為0.5～1 cm?？瞻捉M大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

2.3 模型評價

再灌注完成后1 h，待大鼠完全蘇醒后進行神經(jīng)功能缺損評分。參照ZeaLonga 5分制評分標準［3］: 0分:無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:大鼠不能完全伸展對側(cè)的前爪;2分:大鼠向前爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:大鼠向前爬行的時候向?qū)?cè)傾倒;4分:大鼠不能自發(fā)行走，意識喪失。被評為1～3分的大鼠均可納入實驗組，而0分或4分的大鼠因未達標予以排除。實驗結(jié)束后，清點各組大鼠死亡情況，計算各組大鼠死亡率。

2.4 干預因素施加

空白對照組不施加任何干預因素，正常飼養(yǎng)至實驗結(jié)束，取材進行指標檢測。假手術(shù)組按照上述假手術(shù)模型復制方法進行假手術(shù)模型復制后，不施加任何其他干預因素，至再灌注24 h取材進行相關指標檢測。模型對照組按照上述模型復制方法進行MCAO模型復制后，不施加任何其他干預因素，至再灌注24 h取材進行相關指標檢測。眼針組按照上述模型復制方法進行MCAO模型復制后，再灌注即刻進行針刺治療，之后每8 h進行1次針刺治療，至再灌注24 h取材進行相關指標檢測。

2.5 樣本采集

各組大鼠于再灌注24 h后斷髓處死，剝離完整大腦浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常溫固定24 h后轉(zhuǎn)至4℃冰箱中保存，用于免疫組織化學檢測。

2.6 各組大鼠大腦海馬組織中的P38MAPK、ERK1/2和JNK表達水平檢測

采用免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK表達水平。

將固定好的腦組織常規(guī)制備石蠟切片，脫蠟至水，經(jīng)抗原修復及去除內(nèi)源性過氧化酶后，采用SP法對切片中P38MAPK、ERK1/2和JNK的表達水平進行檢測，分別經(jīng)一抗(1∶300)、二抗(1∶500)孵育后DAB顯色，數(shù)碼顯微鏡下采集圖像，采用BI-2000微循環(huán)和醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定各組大鼠腦組織切片的平均光密度值，并進行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

表1顯示，各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果，模型復制組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著高于空白對照組和假手術(shù)組(P＜0.01)，而空白對照組和假手術(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分(±s)

注:*P＜0.01 vs control group;#P＜0.01 vs sham operation group

組別 鼠數(shù)neurological deficit scores Control 8 0.000±0.000 sham operation 8 0.125±0.354 model 18 2.333±0.594*#

4.2 各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達水平檢測

表2、圖 1～4顯示，各組大鼠海馬組織中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達水平結(jié)果與空白對照組比較，模型對照組和眼針組大鼠腦組織中P38MAPK、JNK蛋白表達水平均顯著升高(P＜ 0.01);與模型對照組比較，眼針組大鼠腦組織中P38MAPK、JNK蛋白表達水平顯著下降(P＜0.05)。

表2 各組大鼠海馬組織中p38MAPK、ERK1/2、JNK表達水平比較(±s)

表2 各組大鼠海馬組織中p38MAPK、ERK1/2、JNK表達水平比較(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.01;與模型對照組比較:#P＜0.05

組別 鼠數(shù)p38MAPK ERK1 ERK2 JNK空 白 對 照 組 6 0.164±0.022 0.161±0.023 0.153±0.016 0.154±0.013假 手 術(shù) 組 6 0.153±0.026 0.156±0.034 0.154±0.028 0.157±0.03模 型 對 照 組 6 0.494±0.037* 0.507±0.047* 0.529±0.041* 0.512±0.038*眼 針 組 6 0.404±0.03*# 0.598±0.062*# 0.573±0.027*# 0.401±0.031*#

圖1 各組大鼠海馬組織中p38MAPK表達

圖2 各組大鼠海馬組織中ERK1表達

圖3 各組大鼠海馬組織中ERK2表達

圖4 各組大鼠海馬組織中JNK表達

5 討論

5.1 八區(qū)八穴取穴法

眼針療法由彭靜山教授首創(chuàng)，并根據(jù)人體眼周穴位分布，將眼周分為八區(qū)十三穴。田維柱是彭靜山的高徒，多年來對眼針療法有改進、充實、發(fā)揚和提高。為提高“眼針療法”臨床療效，近20余年田維柱經(jīng)過不斷學習、理解、實踐改進并簡化了眼針分區(qū)，將原有的“八區(qū)十三穴”合并為“八區(qū)八穴”。多年的臨床應用證明，田維柱眼針分區(qū)定穴的有效性和科學性，簡化眼針分區(qū)定穴提高了臨床療效，完善并發(fā)揚了眼針技術(shù)。

5.2 MAPK信號傳導通路與腦缺血再灌注損傷

研究表明，在線粒體內(nèi)蛋白激酶包括p38MAPK、JNK、ERK1/2以及Raf-l、Src、Fyn、PKA、PKB/Akt、PKC這些蛋白激酶都在細胞分化和細胞調(diào)亡中扮演著重要角色，它們可使細胞調(diào)亡前引導蛋白或抗調(diào)亡蛋白(Bad，Bax，Bcl-xL)發(fā)生磷酸化，從而導致電位或信號的傳導。諸多實驗證實了這些蛋白激酶在線粒體膜內(nèi)外移動或存在于在體或離體細胞線粒體的胞漿中［4-7］，提示這些蛋白激酶在線粒體中進行遷移，從而在腦缺血再灌注損傷中起重要作用。

結(jié)果顯示，與空白對照組和假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠海馬和腦皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的p38MAPK、JNK、ERK1/2表達水平顯著升高，提示在腦缺血再灌注發(fā)生的過程中，p38MAPK、JNK、ERK1/2表達上調(diào)，從而激活p38MAPK信號傳導通路造成腦損傷，該研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致［8-11］。而眼針干預后，p38MAPK、JNK表達水平得到顯著抑制，而ERK1/2表達水平提高，提示我們眼針可能通過抑制p38MAPK及JNK的表達，促進ERK1/2信號傳導通路的激活而實現(xiàn)其腦保護作用。

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The Effects of MAPK Signal Transduction Pathway in Rat Hippocampus Pattern of Ischemia Reperfusion in 24h by Eye Acupuncture's Eight Districts 8 Points

ZHANG Wei1，Ma Xian-de2，Tian Wei-zhu△
(1．Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China; 2．Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

To observe the influence of the P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression in rats hippocampus cerebral ischemia reperfusion and to explore its mechanism．Methods:40 male SD rats were randomly divided into control group(8 rats)，sham operation group(8 rats)and model group(24rats)．The line plug method was used to replicate the model in model group．After evaluation，the qualified rats were divided into model group and eye acupuncture group．So the groups were divided as follows:control group，sham operation group，model group and eye acupuncture group．After cerebral ischemia and reperfusion，The rats were treated with acupuncture immediately，then treated with acupuncture at every 8h until to 24h of ischemia reperfusion respectively．Immunohistochemical method detect MAPK three mainly subfamily P38MAPK pathway，ERK1/2 and JNK protein expression．Results compared with the control group，the levels of P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression were significantly increased in the model control group and the eye acupuncture group，compared with the model group，the P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression in rats hippocampus were significantly decreased．Conclusion:eye acupuncture may play a protective role in the p38-MAPK signal transduction pathway．

Eight Districts 8 Points;cerebral ischemia reperfusion;eye acupuncture;p38MAPK;JNK;ERK．

R246．8

B

1006-3250(2016)01-0239-03

2015-06-03

遼寧省科技廳博士科研啟動基金項目(20131073);國家中醫(yī)藥管理局遼寧彭氏眼針學術(shù)流派傳承工作室建設項目(LPGZS2012-09)

張 威(1978-)女，沈陽人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事針灸學與神經(jīng)病學和眼針療法的理論與臨床研究。

△通訊作者:田維柱(1942)，男，遼寧海城市人，主任醫(yī)師，博士研究生導師，從事針灸學與中醫(yī)內(nèi)科學以及眼針療法的理論與臨床研究。