馮婷婷，冀林華，劉芳，韓園芳，任榮，胡一博，李建平，熊華，尹啟超，崔森

(青海大學附屬醫(yī)院，西寧810001)

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慢性高原病患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞增殖及凋亡變化

馮婷婷，冀林華，劉芳，韓園芳，任榮，胡一博，李建平，熊華，尹啟超，崔森

(青海大學附屬醫(yī)院，西寧810001)

目的 觀察慢性高原病(CMS)患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞增殖、凋亡變化。方法 提取16例CMS患者(CMS組)及16例單純陳舊性骨折患者(對照組)骨髓單個核細胞(BMMNCs)，用免疫磁珠法分選CD71+、CD235a+有核紅細胞。用CCK-8法檢測骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞增殖能力，Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術測算細胞凋亡率，集落形成實驗測算骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞及BMMNCs克隆形成率。結果 與對照組比較，CMS組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞增殖能力升高，凋亡率降低(P均<0.05)。培養(yǎng)第7、14天，兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞克隆形成率比較，P均>0.05；兩組BMMNCs克隆形成率比較，P均<0.05。結論 CMS患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞增殖增加、凋亡減少。

高原病，慢性；CD71+有核紅細胞；CD235a+有核紅細胞；細胞增殖；細胞凋亡

慢性高原病(CMS)是高原常見疾病。在海拔2 500 m以上地區(qū)，機體進行自我調(diào)節(jié)以適應高原環(huán)境。但CMS是機體對高原低氧環(huán)境代償功能失調(diào)而引起紅細胞的過度積累，進而導致整個機體損害。目前有關CMS患者紅細胞增殖與凋亡失衡的報道較少。2014年3月～2015年10月，本研究對16例CMS患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞的增殖與凋亡情況進行檢測，以進一步了解紅細胞過度積累的機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本院收治的CMS患者16例(CMS組)，符合第六屆國際高原醫(yī)學和低氧生理學術大會的CMS診斷標準[1]。均為漢族男性，年齡(46.43±7.1)歲；血紅蛋白(Hb)(224.87±10.6)g/L，動脈血氧飽和度(SaO2)(82.28±9.8)%，血細胞比容(Hct)(66.94±3.8)%。單純陳舊性骨折患者16例作為對照組，均為漢族男性，年齡(43.61±6.1)歲；Hb(145.50±10.1)g/L，SaO2(97.26±8.7)%，Hct為(44.51±3.1)%；血象及骨髓象均正常，與健康人骨髓涂片無差別。兩組居住海拔均為2 500～4 000 m；均排除感染、惡性腫瘤及其他系統(tǒng)系疾病。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義。研究獲得青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會同意。患者知情同意。

1.2 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞分選 CMS組與對照組均于髂后上棘處采集骨髓液10 mL，肝素抗凝。采用密度梯度離心法提取骨髓單個核細胞(BMMNCs)，將分離好的BMMNCs制成單細胞懸液，臺盼藍染色后進行細胞計數(shù)；根據(jù)細胞計數(shù)加入CD71抗體10～20 μL，4 ℃孵育15 min后進行磁珠分選，取CD71+細胞，剩余CD71-細胞。磁珠buffer重懸CD71-細胞進行細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)加入CD235a抗體，4 ℃孵育15 min后進行磁珠分選，取CD235a+細胞，將分選后的CD71+、CD235a+細胞混勻后進行細胞計數(shù)。磁珠分選后以流式細胞術進行細胞純度分析，單次分選后純度均在85%以上。

1.3 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。取分選好的CD71+、CD235a+有核紅細胞按1×104/孔接種于96孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2、3% O2、飽和濕度三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；加CCK-8 10 μL孵育4 h，用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值(OD值)作為骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞生長情況。實驗設3個平行孔，取平均值。

1.4 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞凋亡率測定 采用Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術。取分選好CD71+、CD235a+有核紅細胞(1×106)，PBS洗滌2次，重懸后移入流式管，加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL避光反應15 min后上機檢測，采集10 000個細胞進行分析。Annexin V+PI-細胞為早期凋亡細胞，Annexin V+PI+細胞為晚期凋亡細胞，以二者總和計算細胞凋亡率。

1.5 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞、BMMNCs克隆形成率測算 采用集落形成實驗。選取分選好的CD71+、CD235a+有核紅細胞接種于含有0.9%甲基纖維素、30% FBS、4 mol/L 2-巰基乙醇及1%雙抗的IMDM培養(yǎng)體系中，加入重組人促紅細胞生成素(EPO)3 IU、重組人白細胞介素3 20 ng，接種于6孔板，調(diào)整細胞為1×104/孔。實驗設2個復孔?？装逯車覲BS，保持濕度。于37 ℃、5%CO2、3%O2、飽和濕度三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第7、14天觀察并計算克隆形成率。BMMNCs接種、培養(yǎng)同上，調(diào)整細胞為1×105/孔，培養(yǎng)第7天觀察紅細胞集落生成單位(CFU-E)數(shù)量，計算克隆形成率；培養(yǎng)第14天觀察CFU-E及紅細胞爆裂型集落生成單位(BFU-E)數(shù)量，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

2 結果

2.1 兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞增殖比較 CMS組、對照組OD值分別為1.037±0.276、0.499±0.158，兩組比較，P<0.05。

2.2 兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞凋亡率比較 CMS組、對照組CD71+、CD235a+有核紅細胞凋亡率分別為(5.00±2.76)%、(14.25±11.76)%，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細胞克隆形成率比較 培養(yǎng)第7天 CMS組、對照組克隆形成率分別為(7.82±4.93)%、(4.88±3.57)%，兩組比較，P>0.05。培養(yǎng)第14天，CMS組、對照組克隆形成率分別為(8.93±6.47)%、(6.67±3.50)%，兩組比較，P>0.05。

2.4 兩組BMMNCs克隆形成率比較 培養(yǎng)第7天，CMS組、對照組BMMNCs克隆形成率分別為(19.02±1.95)%、(15.89±4.34)%，兩組比較，P<0.05。培養(yǎng)第14天，CMS組、對照組BMMNCs CFU-E克隆形成率分別為(22.89±3.81)%、(17.89±3.18)%，兩組比較，P<0.05；CMS組、對照組BMMNCs BFU-E克隆形成率分別為(2.42±0.70)%、(1.96±0.53)%，兩組比較，P<0.05。

3 討論

CMS是近年研究的熱點，對其發(fā)病機制的研究取得較大進展。細胞增殖、信號途徑、造血調(diào)控因子[2]、微血管密度、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、其他細胞調(diào)控因子[3～6]及細胞凋亡[7]等均對CMS的發(fā)病有一定影響。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可能通過提高缺氧誘導因子1α(HIF-1α)及HIF-2α水平促使機體產(chǎn)生EPO和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，而EPO和VEGF可促進紅細胞生成[8]。另有研究表明，CMS的發(fā)生亦與基因有關，兒童時期HIF-1α及HIF-2α基因表達高的個體，成年后在高海拔地區(qū)易發(fā)生CMS[9]。同時CMS患者亦會表現(xiàn)為輕度睡眠呼吸暫停和氧化應激[10]，從而加重患者的缺氧狀態(tài)。CD71在紅系前體細胞階段表達較高，隨著紅系發(fā)育成熟，表達逐漸降低[11]；而CD235a表達與CD71的表達相反，隨著紅系發(fā)育成熟其表達逐漸升高[12]。CD71+、CD235a+有核紅細胞可作為骨髓有核紅細胞群體的代表。本研究結果顯示，與對照組比較，CMS組細胞凋亡率降低，CMS組BMMNCs凋亡減少，細胞增殖比例增加，有核紅細胞產(chǎn)生累積效應。蔡玉亮等[7]研究表明，CMS的主要發(fā)病機制與BMMNCs凋亡減少、增殖增加有關；血紅蛋白與BMMNCs增殖并無明顯相關性。與本研究結果相符。

CD71+、CD235a+有核紅細胞屬于造血干細胞所分化出來的有核紅細胞，到成熟細胞分裂次數(shù)僅為3～5次，不易形成集落，僅形成集簇。進行集簇計數(shù)，在第7、14天時兩者并無明顯差異。采用BMMNCs進行集落培養(yǎng)，第7天時CFU-E、第14天時CFU-E及BFU-E克隆形成率，與對照組相比均明顯增高。說明CMS組有核紅細胞增殖能力增高。低氧環(huán)境可能活化了紅細胞信號轉(zhuǎn)導通路[13]，由于信號通路的作用而導致有核紅細胞生成增加。本研究中細胞培養(yǎng)第7、14天時兩組有核紅細胞克隆形成率比較無統(tǒng)計學意義，這可能與有核紅細胞成熟有關。在觀察時部分有核紅細胞已經(jīng)成熟，形成成熟紅細胞，無法觀察集簇的形成。紅細胞生成信號通路是個復雜的通路[14]，CMS組在長期缺氧的環(huán)境中可能導致數(shù)條信號通路增強，進而導致紅細胞累積。提示CMS組增殖能力高于對照組。CD71+、CD235a+有核紅細胞凋亡減少，亦可能與紅細胞信號通路轉(zhuǎn)導增強有關。

因此，CMS發(fā)生機制可能與有核紅細胞的增殖與凋亡失衡有關，未來可進一步深入研究紅細胞信號通路，對紅細胞信號通路與CMS的關系進行進一步探究。

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基金項目：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題(Z2014146)；廣西科技攻關計劃項目(桂14124004-1-5)。

通信作者：何升(E-mail: 963890708@qq.com)

青海省科技廳國際合作項目(2014-HZ-808)。

冀林華(E-mail:13997244508@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.018

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2016-02-20)