溫見(jiàn)翔，楊虹（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳518036）

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四種外排泵抑制劑逆轉(zhuǎn)陰溝腸桿菌耐藥性效果比較

溫見(jiàn)翔，楊虹
（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳518036）

摘要：目的 比較四種外排泵抑制劑碳氰間氯苯腙（CCCP）、利血平維拉帕米奧美拉唑逆轉(zhuǎn)陰溝腸桿菌耐藥性的效果。方法 收集多重耐藥陰溝腸桿菌36株，采用E-test方法檢測(cè)頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氨曲南對(duì)菌株的最低抑菌濃度（MIC），再分別檢測(cè)加入CCCP、利血平維拉帕米奧美拉唑后菌株對(duì)抗菌藥物的MIC，加入外排泵抑制劑后，MIC下降4倍或以上者判斷為外排陽(yáng)性。結(jié)果 加入外排泵抑制劑后，篩選外排陽(yáng)性株陽(yáng)性率由高到低依次為CCCP 34．72%、利血平13．89%、奧美拉唑9．72%、維拉帕米5．56%；環(huán)丙沙星加入CCCP后外排陽(yáng)性株數(shù)量最多，陽(yáng)性率為58．33%。結(jié)論 四種外排泵抑制劑均可不同程度地逆轉(zhuǎn)陰溝腸桿菌的耐藥性，CCCP逆轉(zhuǎn)陰溝腸桿菌的耐藥性效果最佳。

關(guān)鍵詞：陰溝腸桿菌；碳氰間氯苯腙；利血平；維拉帕米；奧美拉唑

陰溝腸桿菌是臨床常見(jiàn)的條件致病菌之一，是醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，陰溝腸桿菌在抗菌藥物的選擇性壓力下出現(xiàn)高耐藥性和多重耐藥［1，2］。本研究對(duì)碳氰間氯苯腙（CCCP）、利血平維拉帕米奧美拉唑四種外排泵抑制劑逆轉(zhuǎn)陰溝腸桿菌耐藥性的效果進(jìn)行比較，為多重耐藥陰溝腸桿菌感染的治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料 收集2010年5月～2013年6月北京大學(xué)深圳醫(yī)院患者痰液、尿液、血液、膿液、膽汁等標(biāo)本中分離的多重耐藥陰溝腸桿菌36株［3］。使用Micro ScanWalkaway40細(xì)菌分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，同一患者同一部位分離出的陰溝腸桿菌，如藥敏結(jié)果相同，僅采用首次分離菌株。以大腸桿菌

ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株，藥敏結(jié)果依據(jù)CLSI（2013年）臨床微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)判定。頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氨曲南E-test藥敏試紙和光度比濁儀為法國(guó)梅里埃生物公司產(chǎn)品；CCCP購(gòu)自Sigma公司，利血平購(gòu)自廣東邦民制藥廠，維拉帕米購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司，奧美拉唑購(gòu)自陜西博森生物制藥廠。

1．2外排泵抑制劑工作濃度的確定 采用外排泵抑制劑的抑菌試驗(yàn)。分別配制含有不同終濃度外排泵抑制劑的MH瓊脂平板，其中CCCP的終濃度分別為5、10、15、20 μg／mL；利血平、維拉帕米、奧美拉唑的終濃度分別為20、40、60、80 μg／mL。分別將大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853及36株多重耐藥陰溝腸桿菌接種含有不同終濃度外排泵抑制劑的MH瓊脂平板，以不含任何外排泵抑制劑的MH瓊脂平板做為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)16 ～18 h，觀察各菌株在含有不同終濃度外排泵抑制劑的MH瓊脂平板的生長(zhǎng)情況，以各菌株不受抑制、生長(zhǎng)良好的外排泵抑制劑最高濃度作為其工作濃度。最終確定CCCP、利血平、維拉帕米、奧美拉唑的工作濃度分別為10、40、60、60 μg／mL。

1．3外排泵抑制劑逆轉(zhuǎn)陰溝腸桿菌耐藥性作用觀察 采用E-test方法分別測(cè)試36株陰溝腸桿菌對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星及氨曲南的MIC。相同方法分別檢測(cè)加入CCCP、利血平維拉帕米奧美拉唑后，陰溝腸桿菌對(duì)孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星和氨曲南的MIC。加入外排泵抑制劑后MIC下降4倍或以上判斷為外排陽(yáng)性。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

3　討論

細(xì)菌的外排系統(tǒng)是通過(guò)細(xì)菌主動(dòng)外排泵將擴(kuò)散入菌體內(nèi)的藥物或其他底物排出膜外，從而加強(qiáng)細(xì)菌在藥物選擇壓力下的生存能力，它是細(xì)菌的一種非特異性耐藥機(jī)制［4］。耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化家族AcrAB-TolC外排系統(tǒng)是導(dǎo)致革蘭陰性菌多重耐藥的重要因素［5～7］。陰溝腸桿菌染色體上存在AcrA、AcrB、AcrR、TolC基因，可以編碼AcrAB-TolC外排泵［8］，多重耐藥的陰溝腸桿菌存在活躍的AcrABTo1C外排泵，陰溝腸桿菌多重耐藥與主動(dòng)外排系統(tǒng)有關(guān)［9～11］。我們的前期研究顯示，我院臨床分離的陰溝腸桿菌高水平攜帶AcrAB-TolC系統(tǒng)的AcrA、AcrB、AcrR、TolC四種基因［3］。外排泵抑制劑不僅可以抑制耐藥細(xì)菌對(duì)藥物的外排，恢復(fù)其對(duì)藥物的敏感性，而且可以改善某些藥物的藥動(dòng)學(xué)特性（如提高口服藥物的吸收率，改善肝、腎清除率）［12］。本研究選取了頭孢菌素類(lèi)的頭孢曲松、氨基糖苷類(lèi)的慶大霉素、喹諾酮類(lèi)的環(huán)丙沙星以及單環(huán)酰胺類(lèi)的氨曲南作為外排泵底物，觀察外排泵抑制劑CCCP、利血平、維拉帕米、奧美拉唑?qū)?6株多重耐藥陰溝腸桿菌MIC的影響。結(jié)果顯示，加入外排泵抑制劑后，篩選外排陽(yáng)性株陽(yáng)性率由高到低依次為CCCP、利血平、奧美拉唑、維拉帕米。四種外排泵抑制劑與慶大霉素和環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用后，逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的效果較好。環(huán)丙沙星加入CCCP后篩選陽(yáng)性菌株最多，陽(yáng)性率為55．56%，慶大霉素亦是與CCCP聯(lián)合使用后篩選的陽(yáng)性率最高（47．22%）。外排泵抑制劑對(duì)頭孢曲松MIC的影響最小，與CCCP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)僅出現(xiàn)3株陽(yáng)性菌株，而與利血平、維拉帕米作用后均未出現(xiàn)陽(yáng)性株。氨曲南與外排泵抑制劑共同作用后，僅有6株外排陽(yáng)性菌株。分析其原因可能是陰溝腸桿菌對(duì)頭孢類(lèi)和單環(huán)酰胺類(lèi)抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要是在抗菌藥物的誘導(dǎo)下，細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，包括AmpC酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯酶等［13］。AmpC酶可水解三代頭孢菌素而不被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，ESBLs能夠滅活三代頭孢菌素和氨曲南等抗菌藥物。而主動(dòng)外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌對(duì)頭孢類(lèi)和單環(huán)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥作用較小。

綜上所述，四種外排泵抑制劑對(duì)我院分離的多重耐藥陰溝腸桿菌均有不同程度耐藥逆轉(zhuǎn)作用，CCCP逆轉(zhuǎn)陰溝腸桿菌的耐藥效果最佳。外排泵抑制劑與抗菌藥物聯(lián)合使用為逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥提供了新的思路，但由于CCCP、利血平、維拉帕米、奧美拉唑的實(shí)驗(yàn)劑量遠(yuǎn)大于臨床常用劑量，不良反應(yīng)較大，因此目前僅限于體外實(shí)驗(yàn)，能否用于臨床仍需進(jìn)一步研究。

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收稿日期：（2015-08-24）

基金項(xiàng)目：廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201203016）。

中圖分類(lèi)號(hào)：R378．2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X（2016）02-0064-02

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．027