牛 剛

淺談禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)注意事項(xiàng)

牛 剛

（河北省涿州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北涿州 072750）

禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)可用于血清中抗體水平的監(jiān)測(cè)，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)。這兩種試驗(yàn)在實(shí)踐中應(yīng)用的比較多，但也容易出錯(cuò)，現(xiàn)對(duì)該試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)做一探討。

禽流感血凝；血凝抑制試驗(yàn)；移液槍；保存

1 樣品的保存及試驗(yàn)前處理

（1）采集的血液樣品應(yīng)及時(shí)分離血清，離心后吸出血清，對(duì)應(yīng)編號(hào)冷藏送檢，并禁止運(yùn)輸過(guò)程中劇烈震動(dòng)。

（2）一般情況下，在5d內(nèi)檢測(cè)的樣品可放置在4℃的冰箱中冷藏，待檢血清超過(guò)1周的需低溫冷凍保存。

（3）在檢測(cè)前血清樣品應(yīng)充分混勻，混勻時(shí)采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩而引起產(chǎn)生氣泡。

（4）對(duì)出現(xiàn)膠凍狀的血清樣品，要反復(fù)攪動(dòng)幾下再離心有助于緩解該狀態(tài)?？赡苁怯捎诜胖脮r(shí)間不夠造成的血清未完全析出，不建議直接吸取其中少量的清亮血清。

2 試劑的保存及配置

（1）禽流感血凝抑制試驗(yàn)所用的抗原應(yīng)保存在-20℃，試驗(yàn)前應(yīng)提前將其恢復(fù)至室溫，反復(fù)凍融會(huì)降低抗原的滴度，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

（2）pH7.2、0.01mol/L的PBS液的制備：應(yīng)盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，不應(yīng)保存太久；

每次使用前應(yīng)測(cè)PH值，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致PH值發(fā)生改變；不建議使用生理鹽水；全部試驗(yàn)均采用同一種稀釋液。

（3）1%紅細(xì)胞的制備

為避免有些雞只的紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)最好選擇2～3只SPF雞或未進(jìn)行過(guò)任何免疫過(guò)的成年公雞血液。采血時(shí)將血液與等體積阿氏液混合，以防血液凝固。

經(jīng)2000～3000r/min，5～10min，棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過(guò)大使紅細(xì)胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復(fù)幾次直至上清液清亮透明為止。

制備好的紅細(xì)胞液如果放置后上清液變紅，說(shuō)明有溶血，不可再使用。不用的紅細(xì)胞懸液應(yīng)4℃冷藏，且不超過(guò)2d。

3 四單位抗原的配制

（1）四單位抗原應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。先對(duì)抗原做血凝試驗(yàn)，以抗原和紅細(xì)胞完全凝集的孔作為抗原效價(jià)，再根據(jù)抗原效價(jià)配制四單位抗原。

（2）每次做試驗(yàn)前，必須重新檢測(cè)禽流感抗原的血凝效價(jià)，以免效價(jià)發(fā)生改變而導(dǎo)致抗原稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。

（3）為保證配制的四單位抗原準(zhǔn)確，還要進(jìn)行回標(biāo)試驗(yàn)。具體方法：做二排抗原回標(biāo)，在第一、二排的第1～4孔各加25微升PBS，取四單位抗原25微升加在第1孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25微升，各孔再加25μlPBS，然后各孔加25微升1%紅細(xì)胞，震蕩10s，靜置30min觀察結(jié)果。第二孔完全凝集表明四單位抗原配制準(zhǔn)確，如果抗原回滴試驗(yàn)不成立，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整抗原濃度直至回標(biāo)試驗(yàn)成立。因?yàn)槿绻乖瓭舛冗^(guò)高，則所測(cè)定的抗體效價(jià)水平偏低，如果抗原濃度過(guò)低，則所測(cè)定的效價(jià)偏高，所以不調(diào)整抗原濃度至回標(biāo)試驗(yàn)成立的話會(huì)對(duì)結(jié)果有很大影響。

4 移液槍的使用

（1）使用時(shí)應(yīng)采用一檔吸液二檔排液的方法。

（2）吸取液體時(shí)，槍頭要深入液下緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時(shí)應(yīng)加在板孔底部。倍比稀釋血清時(shí)，應(yīng)每孔至少反復(fù)吹吸6次，以便混合均勻，還應(yīng)注意盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。

（3）加樣、倍比稀釋時(shí)應(yīng)高度集中注意力，以免漏加、重復(fù)加樣等。

5 結(jié)果的判定

每次試驗(yàn)必須設(shè)陽(yáng)性及陰性（空白）對(duì)照血清，判別試驗(yàn)是否成立。判讀結(jié)果時(shí)，將酶標(biāo)板傾斜45°，以孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無(wú)凝集顆粒為凝集完全抑制。

6 試驗(yàn)器具的清洗

每次試驗(yàn)完畢后，應(yīng)將酶標(biāo)板中液體甩凈，然后用自來(lái)水反復(fù)沖凈每個(gè)孔，再放入3%NaOH中4h，清水反復(fù)沖凈，再放入3%HCl中4h，清水反復(fù)沖凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗幾次，甩干水份，入干燥箱中干燥備用。實(shí)驗(yàn)用燒杯、量筒等也應(yīng)充分洗凈、高壓消毒、干燥，以免器具內(nèi)有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗(yàn)結(jié)果。

7 小結(jié)

影響禽流感血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的因素很多，需要各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格操作，平時(shí)多加練習(xí)，才能為實(shí)際的免疫工作提供準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

［1］ 王延樹(shù)，張芳.血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作要領(lǐng)［J］.中國(guó)動(dòng)物保健，2009，11（8）：75-76.

［2］ 舒躍龍，王敏，張燁，等.一種敏感的H5禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)方法［J］.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，（2）：9-10.