李潔，李睿玉，楊紅，馬丹煒，全津瑩，雷波

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究所，四川成都610066；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101）

土壤微生物多樣性的研究方法

李潔1，李睿玉2，楊紅1，馬丹煒2，全津瑩1，雷波1

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究所，四川成都610066；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101）

對土壤微生物多樣性的研究方法進(jìn)行了綜述。其中，微生物平板記數(shù)法僅能簡單反映樣品中微生物的類型和數(shù)量；從生化方面研究微生物多樣性的方法主要包括基于底物利用率的代謝圖譜以及磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法；土壤微生物在基因水平上的多樣性可以用PCR-DGGE和PCR-TGGE技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和末端限制性片段長度多樣性（T-RFLP）等進(jìn)行研究。熒光原位雜交可通過寡核苷酸探針和全細(xì)胞雜交進(jìn)行原位鑒定和計算單個微生物細(xì)胞。目前，基因芯片技術(shù)已在微生物檢測和群落分析中獲得了很大關(guān)注，而高通量測序技術(shù)使得對土壤微生物轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面分析成為可能。

土壤微生物；多樣性；研究進(jìn)展

土壤微生物多樣性包括在棲息地中微生物分類群的多樣性和在微生物分類群內(nèi)的遺傳多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的變異性、相互作用的復(fù)雜性、營養(yǎng)水平（tropic level）和共位群（guild）數(shù)量（功能多樣性）在內(nèi)的生態(tài)多樣性[1]。目前，對土壤微生物多樣性的研究已從傳統(tǒng)的微生物平板計數(shù)法發(fā)展到高通量測序技術(shù)，從僅能對土壤微生物類型和數(shù)量測定發(fā)展到能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測序，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面分析成為可能[2]。筆者對近年來土壤微生物群落多樣性的研究方法進(jìn)行了概述。

1 微生物平板記數(shù)法

微生物平板記數(shù)法是一種傳統(tǒng)研究微生物多樣性的方法，其原理是根據(jù)微生物選擇相應(yīng)的專性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后根據(jù)微生物的菌落形態(tài)和菌落數(shù)來測定微生物的類型和數(shù)量[3]。微生物平板記數(shù)法操作簡單，并且能直接反映樣品中微生物的類型和數(shù)量。其已被應(yīng)用于紫莖澤蘭等外來菊科植物對入侵地土壤微生物多樣性的研究中[4-5]。但是，土壤中的可培養(yǎng)微生物只占微生物總數(shù)的1%左右，該方法的結(jié)果不能準(zhǔn)確反映出土壤中的全部微生物群落結(jié)構(gòu)，需結(jié)合其他方法使用[6]。

2 基于生化技術(shù)的方法

基于生化技術(shù)研究微生物多樣性的方法主要包括基于底物利用測定的群落水平生理特征譜圖（Community-Level Physiologic al Profiling，CLPP）以及磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acids，PLFAs）生物標(biāo)記法。

2.1 基于底物利用率的代謝圖譜

基于底物利用率測定群落水平生理特征譜圖主要是依據(jù)微生物利用底物不同的特性來表征微生物群落代謝功能多樣性，主要方法有底物誘導(dǎo)呼吸法（Substrate-Induced Respiration，SIR）和Biolog微孔板法。

底物誘導(dǎo)呼吸法是基于微生物在純培養(yǎng)時利用底物（如葡萄糖）供應(yīng)在呼吸作用上有直接響應(yīng)的原理，向土壤中加入足夠的葡萄糖，使微生物生物量酶系統(tǒng)達(dá)到飽和，這時CO2的釋放速率與微生物生物量的大小呈線性相關(guān)。因此，可以快速測定土壤微生物生物量。底物誘導(dǎo)呼吸法適用的土壤范圍比較廣，但受土壤pH值和含水量的影響。另外，底物誘導(dǎo)呼吸法的校正系數(shù)的不確定性也使該方法受到爭議[7]。

1991年，Garland和Mills首次將Biolog微孔板用來描述微生物群落水平的生理特性[8]。Biolog微孔板的95個孔中加入95種單一碳源和四唑染料，另外一個孔中加水作為對照[9]，因為微生物對單一碳源底物的利用能力不同，當(dāng)接種菌懸液時會形成不同微生物的指紋。Biolog方法具有快速而可再現(xiàn)的特點。但是，那些不可培養(yǎng)、生長較緩慢的微生物，則不適合該系統(tǒng)的檢測。另外，接種密度和培養(yǎng)時間的差異都會給微生物評價結(jié)果帶來誤差。

反映微生物群落對含碳底物代謝功能多樣性的群落水平生理特征（CommunityLevel Physiological Profile，CLPP）通常被用來評估微生物群落功能的差異。Campbell和Chapman于2003年提出來的MicroRespTM可用于測定CLPP。這種方法結(jié)合Biolog和底物誘導(dǎo)呼吸2種方法的優(yōu)點[10]，在Biolog技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合了碳標(biāo)記技術(shù)，具有耗費低、簡單、快速、靈敏等特點，而且測定對象是全土，因此，其被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的測定群落水平生理特征的方法，已成功應(yīng)用于土壤微生物功能多樣性的分析中[11-13]。

2.2 磷脂脂肪酸法（FAME）

磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acids，PLFAs）是一種有效的生物標(biāo)記物，可以用來反映土壤中微生物群落的結(jié)構(gòu)。PLFAs存在于所有活細(xì)胞中，并且在活細(xì)胞中的含量相對恒定[14-15]，在死亡細(xì)胞中會迅速分解。脂肪酸甲酯分析法（Fatty Acid Methylester，F(xiàn)AME）是一種生化方法，直接從土壤中提取PLFAs，并根據(jù)脂肪酸特異性來了解微生物群落組成，并可對微生物群落進(jìn)行識別和定量描述。磷脂脂肪酸法已應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤[16]、森林土壤[17]、火災(zāi)跡地土壤[18]、入侵植物入侵地土壤等微生物多樣性的研究上，以及醬香大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[19]。該方法結(jié)果的準(zhǔn)確性與磷脂脂肪酸的提取是否完全有很大關(guān)系。

3 基因圖譜技術(shù)

土壤微生物在基因水平上的多樣性可以通過微生物中DNA組成的復(fù)雜性表現(xiàn)出來[20]。一些基于DNA分析、PCR擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于微生物多樣性的分析中。

3.1 PCR-DGGE和PCR-TGGE技術(shù)

變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技術(shù)最先由Fischer和Lerman提出并用于DNA突變檢測。1993年Muyzer將該技術(shù)首次應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究[21]。后來，在該技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展出溫度梯度凝膠電泳（Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE）。目前，PCR-DGGE技術(shù)和PCR-TGGE技術(shù)廣泛應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究中[22-23]。DGGE/TGGE技術(shù)在普通的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度/溫度梯度。其主要是依據(jù)16S rDNA，18S rDNA分子片段的堿基組成差異和二級結(jié)構(gòu)的差異將PCR產(chǎn)物分開。

DGGE技術(shù)是在聚丙烯酰胺凝膠中，加入由尿素和甲酰胺2種變性物質(zhì)形成的由低到高的變性劑梯度，得到具有變性作用的梯度凝膠[24]。因為樣品的退火溫度（Tm）高低不一，因此，電泳時樣品中那些低Tm的雙鏈DNA則在低濃度變性劑作用下就先部分解鏈，而高Tm的雙鏈DNA則要遷移到具有較高變性劑濃度處才能變性解鏈[25]。DNA雙鏈一旦解鏈，其在凝膠中的遷移阻力就會增大，移動的速度就會急劇下降，當(dāng)其到達(dá)某變性濃度，使遷移阻力與電場力相平衡時，就會停留在凝膠的相應(yīng)位置中，從而使得不同的DNA片斷得到分離[26]。TGGE原理與DGGE相似，不同的是TGGE利用溫度梯度代替變性劑梯度。PCR產(chǎn)物在具有固定的變性劑濃度和線性溫度梯度的膠中遷移，從而造成不同DNA片段解鏈時間的差異，區(qū)分為不同的條帶。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30～50個堿基對）可提高DNA片段的解鏈范圍，防止其在最高溫度（或變性劑濃度）時完全解鏈成單鏈DNA分子，這樣能使DNA片段中每個堿基處的差異幾乎都能被區(qū)分開。

PCR-DGGE技術(shù)和PCR-TGGE技術(shù)可以直接對土壤樣品中的微生物多樣性進(jìn)行分析，具有真實、重復(fù)性好、方便快捷，可同時分析大量樣品，無需進(jìn)行分離培養(yǎng)操作等優(yōu)點。其局限性在于存在PCR誤差，需要高保真酶；宏基因組提取時，如果細(xì)胞裂解不充分，也將導(dǎo)致試驗結(jié)果有偏差[27]。

3.2 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析最初被用于檢測DNA點突變。當(dāng)DNA變性解鏈為單鏈時，由于單鏈DNA的空間構(gòu)象與分子內(nèi)堿基組成有關(guān)，一個堿基的差異即可形成不同的構(gòu)象，不同構(gòu)象的DNA在瓊脂糖凝膠電泳上，因泳動速率不同而被分開，故能反映出單鏈DNA片段的多態(tài)性。DNA在瓊脂糖凝膠電泳上復(fù)性是該方法的潛在問題，Schwieger和Tebbe進(jìn)一步完善了這個方法，在電泳前去除了DNA雙鏈的一條鏈，瓊脂糖凝膠上的每條鏈都代表了單一的物種。目前，SSCP已經(jīng)應(yīng)用于研究細(xì)菌和真菌群落[28-31]、根際微生物區(qū)系[32-33]和根際周圍從枝菌根真菌的種類[34-35]。該方法優(yōu)點是不需要DNA片斷帶GC夾和梯度膠；缺點是PCR擴(kuò)增特異性要求高，且擴(kuò)增片段為100～300 bp為佳，易受電泳溫度和凝膠濃度等條件的影響[36]。

3.3 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和末端限制性片段長度多樣性（T-RFLP）

限制性片段長度多態(tài)性（Restrictionfragment Length Polymorphism，RFLP）是一種依據(jù)DNA多態(tài)性研究微生物多樣性的工具。在微生物群落結(jié)構(gòu)分析中，用PCR擴(kuò)增后的rDNA經(jīng)酶切位點為4 bp的限制性酶消化后，不同長度的片段可在瓊脂糖或者非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳上被檢測出來。王英等[37]用RFLP技術(shù)對免耕水稻土壤中細(xì)菌的多樣性和空間分布研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌種類非常豐富，而且在不同層的土壤中存在空間差異性。

末端限制性片段長度多樣性（Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技術(shù)的原理與RFLP相同，不同的是T-RFLP的一個引物用熒光染料如TET（4，7，2′，7′-四氯-6-羧基熒光素）、6-FAM亞磷酰胺（5′-熒光素氨基磷酸酯）等標(biāo)記引物，在所得到的PCR產(chǎn)物的一段就帶有這種熒光標(biāo)記。然后，被幾種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，這樣帶標(biāo)記物的片段就會在瓊脂糖電泳中因為大小不同而分開。由于PCR產(chǎn)物標(biāo)記的是末端，只有末端帶有熒光性標(biāo)記的片段才能被檢測到[38]。

消化產(chǎn)物用測序儀進(jìn)行測定，輸出結(jié)果包括片段的大小和數(shù)量[39]。T-RFLP技術(shù)彌補(bǔ)了RFLP技術(shù)的局限性，簡化了RFLP的條帶圖譜，能夠更加準(zhǔn)確地反映土壤微生物多樣性[40]。許樂等[41]采用T-RFLP技術(shù)對枯萎病不同抗性的香蕉品種的內(nèi)生細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。Ding等[42]采用T-RFLP技術(shù)研究了植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和動態(tài)變化。Barreto等[43]用T-RFLP技術(shù)研究熱帶湖泊沉積物中，細(xì)菌、古細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的空間分布規(guī)律。該方法優(yōu)點是不受菌株是否純培養(yǎng)的限制，不受宿主的干擾，具有特異性強(qiáng)、效率高的特點；缺點是由于PCR擴(kuò)增中引物存在偏好性、共遷移現(xiàn)象，無法鑒定至種甚至屬的水平，導(dǎo)致所能獲得的信息量相對較少，不能檢測出樣品中的全部群落。

4 熒光原位雜交

熒光原位雜交（Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）通過寡核苷酸探針和全細(xì)胞雜交進(jìn)行原位鑒定和計算單個微生物細(xì)胞。FISH的探針通常是5'端帶熒光染料標(biāo)記的18～30個核苷酸片段，通過熒光顯微鏡檢測細(xì)胞rRNA和探針的結(jié)合。熒光信號的強(qiáng)度和細(xì)胞中rRNA的含量與增長率相關(guān)，從而可以檢測到細(xì)胞的代謝狀態(tài)。FISH技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合可以高分辨率地自動分析微生物群落。FISH技術(shù)的缺點是熒光信號強(qiáng)度低和本底熒光干擾，可以通過使用更強(qiáng)的熒光染料、氯霉毒處理使活細(xì)菌細(xì)胞中rRNA含量增多，用多種熒光染料標(biāo)記的探針雜交和用報告酶（reporter enzymes）進(jìn)行信號放大等途徑解決這個問題[44]。

酶聯(lián)熒光原位雜交（Catalyzed Reporter Deposition-FISH，CARD-FISH）在熒光原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上改進(jìn)的一種方法。該方法是利用辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記的探針和酪胺信號放大（Tyramide Signal Amplification，TSA）技術(shù)增強(qiáng)熒光信號的強(qiáng)度[45]。

Li等[46]發(fā)展了一種新的成像技術(shù)，將FISH和次級離子質(zhì)譜（Secondary Ion Mass Spectrometry，SIMS）結(jié)合，空間分辨率達(dá)50 nm，可以在單個細(xì)胞水平上定量分析同位素的組成。其原理是用16S rRNA探針雜交，并用生物體內(nèi)很少見的穩(wěn)定的同位素標(biāo)記，一旦探針與樣品雜交，NanoSIMS成像就會隨即檢測到被穩(wěn)定同位素標(biāo)記的細(xì)胞的微生物特性。FISH技術(shù)具有原位、安全、高靈敏度的特點，已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物多樣性分析中[47-49]。

5 基因芯片

基因芯片技術(shù)已在微生物檢測和群落分析中獲得了很大的關(guān)注。其基本原理是用許多已知序列的核酸（探針）與未知的核酸（靶標(biāo)）雜交進(jìn)行核酸序列測定，這些探針按特定的排列方式固定在固相載體表面，組成微點陣列[50]。標(biāo)記的靶核苷酸與基因芯片上的探針雜交，然后通過檢測雜交信號，從而定性和定量地獲得樣品中的遺傳信息[51]。其具有高密度、高通量的特點。1997年，微點陣列方法開始應(yīng)用到環(huán)境微生物學(xué)中分析微生物群落組成，用9個16S rRNA靶標(biāo)探針鑒定挑選的硝化細(xì)菌。從此，這個領(lǐng)域迅速發(fā)展，如今很多芯片系統(tǒng)組成探針應(yīng)用于測定靶標(biāo)核酸序列[52-54]?；蛐酒夹g(shù)對于那些特殊的土壤微生物的鑒定非常有效，且具有樣品量少、定量的特性。然而對低豐度樣品分析時，PCR技術(shù)的運用雖然增強(qiáng)了基因芯片檢測靈敏性卻降低了真實度[55]。此外，由于對探針序列的要求，該方法不適宜檢測土壤微生物多樣性[56]。

6 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)（High-throughput Sequencing）是最近幾年發(fā)展起來的測序技術(shù)，又稱下一代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing）[57]。相對于20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的Sanger雙脫氧鏈終止法測序技術(shù)成本高、速度慢，高通量測序技術(shù)最顯著的特點是高通量[58]，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測序，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面分析成為可能[59]。測序流程主要包括：克隆文庫的制備、基因組DNA隨機(jī)片段化和端標(biāo)記測序及數(shù)據(jù)分析[60]。高通量測序平臺主要包括Roche公司的GS FLX（Genome Sequencer FLX）測序平臺，Illumina公司的Illumina Genome Analyzer測序平臺，ABI的SOLiD（Supported Oligo Ligation Detetion）測序平臺，這3種高通量測序又稱為第2代測序技術(shù)[61]。其中，GSFLX系統(tǒng)以時間短的優(yōu)勢成為最受歡迎的方法，而Illumina系統(tǒng)數(shù)據(jù)量大、成本低和SOLiD系統(tǒng)準(zhǔn)確度高的特點都將成為今后研究的主要方法[62]。第3代測序技術(shù)平臺有生物科學(xué)（BioScience）公司的HeliScope單分子測序儀（HeliScope Single Molecular Sequencer）、太平洋生物科學(xué)（Pacific Biosciences）公司的單分子實時（Single Molecule Real Time，SMRT）DNA測序技術(shù)和牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies Ltd）的納米孔單分子測序技術(shù)[14]。第3代測序技術(shù)的特點是單分子測序，可以讀取片段長達(dá)1 kb以上，且準(zhǔn)確度高于99.99%[63]。高通量測序技術(shù)已被應(yīng)用到土壤微生物多樣性的研究中[64]。

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Research Methods of Soil Microbial Diversity

LI Jie1，LI Ruiyu2，YANGHong1，MADanwei2，QUANJinying1，LEI Bo1
（1.Institute of Agricultural Information and Rural Economy，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2.College ofLife Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China）

Research methods of soil microbial diversity were summaried in this paper.The microorganism plate numeration only reflected the types and quantity of microorganism in soil.The metabolism map based on substrate utilization and phospholipid fatty acid biology marker methods were used to study the biochemical characters of microorganism.The microbial diversity in genetic level was studied by PCR-DGGE,PCR-TGGE,SSCP,RFLP and T-RFLP.The fluorescence in situ hybridization was used to situ identification and calculate the single microbial cell by oligonucleotide probe and the whole cell hybridization.At present,the gene chip technology was used to microbial detection and microbial group analysis.The high flux sequence technology could be used to analyze the transcript profile and genome of microorganism in soil.

soil microorganism;diversity;research progress

S154.3

A

1002-2481（2016）11-1738-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.38

2016-05-26

四川省科技文獻(xiàn)共享服務(wù)平臺（2015-2016）

李潔（1978-），女，四川中江人，助理研究員，碩士，主要從事植物生理及農(nóng)業(yè)信息研究工作。雷波為通信作者。