于冰雪，吳健林，吳繼周，龔婷婷，王尊付，鐘彬

(1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院)

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p53基因第7、8外顯子突變與廣西肝癌家族聚集遺傳易感性的關系

于冰雪1，吳健林1，吳繼周1，龔婷婷1，王尊付2，鐘彬1

(1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院)

目的 探討p53基因第7、8外顯子突變(exon7/exon8)與廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌家族聚集遺傳易感性的關系。方法 依配對方法選擇廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌高發(fā)家族、肝癌單發(fā)家族和無癌家族中未發(fā)生肝癌的家族成員各123例為家族組，同時選擇廣西肝癌高發(fā)區(qū)內(nèi)30例肝癌患者作為肝癌組。控制HBV、HCV感染及環(huán)境因素后，應用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)性分析結合基因測序的方法篩查p53基因exon7/exon8突變情況。結果 肝癌組p53基因exon7/exon8總突變率為13.3%(4/30)，家族組exon7/exon8總突變率為0，P<0.05。結果 p53基因exon7/exon8突變可能不是廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌家族聚集的遺傳易感因素。

原發(fā)性肝癌；家族聚集性；p53基因；基因突變；聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)性分析；廣西

廣西是我國肝癌高發(fā)區(qū)之一，具有明顯的肝癌家族聚集現(xiàn)象[1]。肝癌家族聚集現(xiàn)象的本質(zhì)被認為是遺傳基因改變因素與肝癌發(fā)生之間存在密切相關性[2,3]，主要與原癌基因的激活和抑癌基因的失活有關。p53基因被認為是人類腫瘤中最常發(fā)生突變的抑癌基因，第7、8外顯子(exon7/exon8)突變作為肝癌中p53基因突變熱點的一部分[4]，與廣西肝癌家族聚集現(xiàn)象之間有何種聯(lián)系？是否會發(fā)生在廣西肝癌家庭成員中？廣西肝癌家庭成員是本身就攜帶p53基因exon7/exon8遺傳突變體，還是在環(huán)境等因素影響下發(fā)生的，尚無此方面的研究報道。2014年3月～2015年1月，我們應用聚合酶鏈式反應(PCR)-單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析結合基因測序的方法初步觀察廣西肝癌高發(fā)區(qū)人群p53基因exon7/exon8突變情況，以了解其與廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌家族聚集遺傳易感性的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇廣西肝癌高發(fā)區(qū)的都安、大化、武鳴、橫縣等10個縣(區(qū))，涉及27個肝癌高發(fā)家族、25個肝癌單發(fā)家族和31個無癌家族，依配對方法選擇性別、年齡、民族、生活環(huán)境、生活習慣、HBV感染、肝功能具有可比性的肝癌高發(fā)家族、肝癌單發(fā)家族和無癌家族中未發(fā)生肝癌的家族成員各123例作為家族組，共369例。其中，男234例、女135例，年齡(29.44±16.72)歲；HBV感染90例，HCV感染0例。肝癌高發(fā)家族成員：直系親屬中發(fā)生過2例及以上肝癌的家族成員；肝癌單發(fā)家庭成員：直系親屬中發(fā)生過1例肝癌的家庭成員；無癌家族成員：直系親屬中未發(fā)生過任何惡性腫瘤病例的家族成員。選擇廣西肝癌高發(fā)區(qū)內(nèi)30例肝癌患者作為肝癌組，均符合第八屆全國肝癌學術會議修訂的診斷標準[5]。其中男22例，女8例，年齡(41.37±11.14)歲；HBV感染11例，HCV感染0例。兩組HBV、HCV感染情況具有可比性(P均>0.05)。

1.2 p53基因exon7/exon8突變篩查方法

1.2.1 標本采集 采集每位研究對象空腹外周血，分裝于無菌離心管內(nèi)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA提取 用人全血基因組DNA提取試劑盒提取，提取后用超微量核酸蛋白分析儀(NanoDrop 2000)直接檢測DNA的濃度和純度，調(diào)節(jié)DNA濃度至80～100 ng/μL，A260/A280值1.6～1.8，合格樣品保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 p53基因exon7/exon8的PCR擴增 根據(jù)參考文獻[6]設計p53基因exon7/exon8特異性序列引物各1對，由上海生工生物工程有限公司合成。Exon7上游引物5′-TAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3′，下游引物5′-TGACCTGGAGTCTTCCAGTGT-3′，序列長度117 bp；Exon8上游引物5′-AGTGGTAATCTACTGGGACGG-3′，下游引物5′-ACCTCGCTTAGTGCTCCCTG-3′，序列長度141 bp。PCR擴增均采用25 μL反應體系，包括PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，去RNA酶水9.5 μL，DNA模板1 μL。PCR擴增條件:exon7為預變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 30 s，退火59 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，末次延伸72 ℃ 10 min。exon8為預變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，末次延伸72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL在2%的瓊脂糖凝膠上電泳(110 V，30 min)，所有研究對象可擴增出目的基因。

1.2.4 SSCP分析 制備12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，加入l×TBE緩沖液(4 ℃)，預電泳30 min備用。取 PCR產(chǎn)物、甲酰胺上樣緩沖液各8 μL，混勻，96 ℃變性10 min，立即冰浴5 min；按序加樣，50 bp DNA ladder marker及未變性PCR產(chǎn)物5 μL作對照。2 00 V電泳180～200 min，至二甲苯青移至凝膠底部時停止。取下凝膠，進行銀染色，10%乙醇10 min，1%硝酸10 min，0.1%硝酸銀10 min，12.5%碳酸鈉溶液(含甲醛1 mL/500 mL)中顯影，至出現(xiàn)清晰條帶；1%乙酸溶液終止顯色，拍照存檔。

1.2.5 結果判定 各樣本間相互比較，單鏈條帶位置存在泳動差異或數(shù)量增多時判定為突變陽性樣本[7]。

1.2.6 基因測序 SSCP陽性標本的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測序，并將測序結果與從NCBI Gene數(shù)據(jù)庫中下載的p53基因exon7/exon8標準序列進行比較。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率表示，組間比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

肝癌組經(jīng)PCR-SSCP分析結合基因測序確定3例p53基因exon7突變和1例p53基因exon8突變，突變率為13.3%(4/30)。家族組肝癌高發(fā)家族、肝癌單發(fā)家族和無癌家族中均未發(fā)現(xiàn)p53基因exon7/exon8突變，突變率為0。肝癌組與家族組肝癌高發(fā)家族、肝癌單發(fā)家族及無癌家族p53基因exon7/exon8突變率差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

3 討論

廣西是我國肝癌高發(fā)區(qū)之一，并具有明顯的肝癌家族聚集現(xiàn)象，其主要危險因素被認為是HBV感染,特別是HBV的復制、飲用塘水和遺傳因素三者共同作用[24]；其中，遺傳因素在肝癌發(fā)生中的作用越來越受到重視。p53基因是一種抑癌基因，是目前發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關性最高的基因。抑癌基因p53突變參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,包括肝癌在內(nèi)大約50%以上的人類惡性腫瘤中出現(xiàn)p53基因突變[8]。本研究在廣西肝癌高發(fā)區(qū)30例肝癌患者中檢測到p53基因exon7/exon8突變，那么在廣西肝癌家庭成員中是否也存在此類突變，是其本身就攜帶p53基因exon7/exon8遺傳突變體，還是在環(huán)境等因素影響下發(fā)生的，國內(nèi)外尚無此方面的研究報道。

本研究將HBV、HCV感染作為混雜因素控制后，檢測廣西肝癌高發(fā)區(qū)內(nèi)肝癌高發(fā)家族、無癌家族、肝癌單發(fā)家族中尚未發(fā)生肝癌的成員中p53基因exon7/exon8，均未發(fā)現(xiàn)突變。p53基因exon7/exon8突變可能不是廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌家族聚集的遺傳易感因素。

在我國肝癌高發(fā)區(qū)，HBV慢性感染常與黃曲霉毒素B1(AFB1)暴露同時存在。兩者在肝癌的發(fā)病中與抑癌基因p53均有一定的聯(lián)系[9,10]。有研究表明，與非乙肝相關性肝癌相比，乙肝相關性肝癌患者中更易檢測出p53基因突變[11]。HBV慢性感染與AFB1長期暴露的協(xié)同效應可能更易引起肝癌患者p53基因突變。Pineau等[12]研究發(fā)現(xiàn)，AFB1低暴露的意大利及法國肝癌患者中p53基因突變檢出率較低，分別為25%、18%，而AFB1高暴露的上海肝癌患者p53基因突變的檢出率達48%，認為AFB1暴露與p53基因突變有一定相關性。肝癌中p53基因突變頻率沒有年齡、性別差異，但HBV-DNA陽性以及AFB1-DNA加合物陽性者p53基因突變頻率高于HBV-DNA以及AFB1-DNA加合物陰性者[13]，AFB1暴露與HBV感染同時存在的情況下，其協(xié)同作用可能引起肝癌中p53 基因突變率更高[14]。此外，p53基因突變更可能發(fā)生在肝癌晚期[15]。由此，與肝癌患者的HBV感染情況、AFB1暴露情況以及病情進展情況等因素有關，這些因素在肝癌的發(fā)病機制中均起到一定作用。本研究在肝癌患者中檢測到p53基因exon7/exon8突變率為13.3%，肝癌家庭成員中p53基因exon7/exon8突變率為0。推測廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌家庭成員可能尚未發(fā)生p53基因exon7/exon8突變或較為罕見，突變可能為后天在多種因素的影響下發(fā)生，并參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

流行病學研究表明，遺傳因素在肝癌的發(fā)病中是存在的，但肝癌不符合單基因遺傳模式，是一種多基因、多因素、多階段的疾病,受遺傳與環(huán)境的綜合影響[16]。在廣西肝癌高發(fā)區(qū)，p53基因exon7/exon8突變可能不是肝癌家族聚集的遺傳易感因素，是否會在后天多種因素的影響下發(fā)生而參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展，尚需進一步研究。

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Correlations between p53 gene mutations in exon 7/8 and genetic susceptibility to familial aggregation of hepatocellular carcinoma in high incidence area of Guangxi

YUBingxue1,WUJianlin,WUJizhou,GONGTingting,WANGZunfu,ZHONGBin

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the relationship between the mutations of exon 7/exon8 of p53 gene and genetic susceptibility to familial aggregation of hepatocellular carcinoma in high incidence area of Guangxi.Methods We selected patients from families who had two or more HCC, families who had only one HCC, and families who had no HCC so far. Each family had 123 cases, and all the families were selected from the high incidence of HCC areas of Guangxi. They were taken as the family groups. Meanwhile, another 30 cases of HCC patients were collected from high incidence of hepatocellular carcinoma as the HCC group. HBV infections, HCV infections and environmental factors were controlled as confounding factors. Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) was used to screen the mutations of exon 7/exon 8 of p53 gene. Results The total mutation rate of exon 7/exon 8 of p53 gene in the HCC group was 13.3% (4/30). The mutation rate of exon 7/exon 8 of p53 gene in the three family groups was 0. There was significant difference between the family groups and the HCC group(P<0.05).Conclusion p53 gene mutations in exon 7/exon 8 may not be the genetic susceptibility factors for familial aggregation of hepatocellular carcinoma in high incidence area of Guangxi.

primary hepatocellular carcinoma; familial Aggregation; p53 gene mutations; polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism analysis; Guanxi

廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019181)。

于冰雪(1989-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要研究方向為肝臟病的發(fā)病機制和診療。E-mail: bingxue1031@163.com

簡介：吳健林(1970-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為病毒性肝炎的基礎與臨床。E-mail: wjl4954@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.007

R735.7

A

1002-266X(2016)38-0023-03

2016-06-11)