何方洋　萬(wàn)宇平　賈芳芳　吳小勝　羅曉琴?。á俦本┣诎钌锛夹g(shù)有限公司北京 昌平　102206?、俦本┦惺称钒踩庖呖焖贆z測(cè)工程技術(shù)研究中心）

文獻(xiàn)綜述

流式細(xì)胞儀在檢測(cè)食品中微生物的應(yīng)用研究

何方洋①①萬(wàn)宇平①①賈芳芳①①吳小勝①①羅曉琴①①（①北京勤邦生物技術(shù)有限公司北京 昌平102206①北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心）

流式細(xì)胞儀（flow cytometer）是流式細(xì)胞術(shù)的商品化應(yīng)用，它作為新型高科技儀器，已應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、海洋、漁業(yè)、釀酒、畜牧、體育科學(xué)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、化工等領(lǐng)域，本文著重介紹了目前流式細(xì)胞儀在檢測(cè)食品中微生物的應(yīng)用研究。

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一項(xiàng)細(xì)胞分析技術(shù)，不僅能夠快速定量分析和分選液流系統(tǒng)中單個(gè)細(xì)胞或其它生物微粒，而且可以實(shí)現(xiàn)分類收集特定細(xì)胞或細(xì)胞器。流式細(xì)胞儀（ flow cytometer）是流式細(xì)胞術(shù)的商品化應(yīng)用，它作為新型高科技儀器，已應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、海洋、漁業(yè)、釀酒、畜牧、體育科學(xué)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、化工等領(lǐng)域，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀在檢測(cè)食品中微生物方面應(yīng)用發(fā)展起來(lái)［1］。檢測(cè)食品中微生物是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生的一個(gè)重要指標(biāo)，目前發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)以及地方標(biāo)準(zhǔn)中涉及到的食品中微生物的檢測(cè)方法主要有：交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法、環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（LAMP）法、免疫磁珠法、分子分型SPA基因分型方法、熒光PCR法、Baird-parker瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法、電泳和免疫印跡法、免疫色譜反應(yīng)法、酶聯(lián)免疫法等［2-10］。隨著人們對(duì)食品安全要求的提高，相對(duì)于其他檢測(cè)手段，流式細(xì)胞術(shù)已成為一種被認(rèn)可的重要分析技術(shù)，利用細(xì)胞能夠自發(fā)熒光，并且標(biāo)記不同的熒光素（蛋白、核酸等），流式細(xì)胞儀通過(guò)散射光可以在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征。

1　流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)、原理及機(jī)型

1.1流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀主要由五個(gè)部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)［11-13］。其中，流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，是液流系統(tǒng)的心臟。

1.2流式細(xì)胞儀原理由于超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動(dòng)室發(fā)生振動(dòng)，因此，能夠把噴嘴噴出的細(xì)胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，其中部分液滴含有細(xì)胞。在待測(cè)細(xì)胞形成液滴前，光學(xué)系統(tǒng)已測(cè)定出細(xì)胞的性質(zhì)，如果發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)細(xì)胞，則在該目標(biāo)細(xì)胞剛形成液滴時(shí)，儀器給整個(gè)液流充以短暫的正電荷或負(fù)電荷。當(dāng)該液滴離開液流后，其中目標(biāo)細(xì)胞的液滴就帶有電荷，而其他細(xì)胞的液滴則不帶電。帶有正電或負(fù)電的液滴通過(guò)高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)，會(huì)發(fā)生向陰極或向陽(yáng)極的偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到了分類收集細(xì)胞的目的。整個(gè)儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號(hào)和光散射信號(hào)，測(cè)定的結(jié)果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來(lái)表示［14-16］。

1.3流式細(xì)胞儀基本機(jī)型目前，主要生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的公司有德國(guó)的Partec公司、美國(guó)的BD公司和貝克曼庫(kù)爾特公司［17-18］。儀器主要分為臨床分析型和科研分選型，前者主要應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室，后者則適于廣泛的科研領(lǐng)域。隨著電子制造技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、熒光素合成等技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀開始向模塊化發(fā)展，其電子系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)器單元等均可以按照試驗(yàn)要求隨意更換［19-20］，以滿足用戶的不同需求。

2　流式細(xì)胞儀在食品微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀曾經(jīng)在第二次世界大戰(zhàn)中用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌和孢子，后來(lái)隨著流式細(xì)胞儀的商業(yè)化發(fā)展，用來(lái)檢測(cè)哺乳類生物細(xì)胞，直到上世紀(jì)90年代末，由于儀器光學(xué)系統(tǒng)的改進(jìn)，以及新熒光素的發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀在微生物學(xué)的應(yīng)用快速發(fā)展起來(lái)。而在食品工業(yè)應(yīng)用中，流式細(xì)胞儀已被應(yīng)用于釀酒、面包發(fā)酵、飲料等行業(yè)［21-23］，它已成為微生物檢測(cè)的常用工具。

2.1應(yīng)用于細(xì)菌活性的判斷流式細(xì)胞儀能夠鑒定食品中微生物的活性，因?yàn)榛罴?xì)胞具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一般的熒光染料無(wú)法進(jìn)入，只能進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞中。而有些染料可以進(jìn)入所有死細(xì)胞和活細(xì)胞內(nèi)，其進(jìn)入量有差別。如果將兩種特性的染料結(jié)合應(yīng)用，配合熒光微球，即可快速鑒別并計(jì)數(shù)死/活細(xì)胞。該特性既可以評(píng)價(jià)食品的殺菌效果，也可以評(píng)價(jià)食品中有益菌的含量［24-26］。

2.2應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)目前，已有學(xué)術(shù)研究報(bào)道利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)生乳、果汁等食品中致病菌數(shù)量，這些報(bào)道同時(shí)也比較了平板計(jì)數(shù)法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)間只需2h左右，而平板計(jì)數(shù)法則需要5d左右，而且在一定濃度范圍內(nèi)，前者具有更好的符合性，更加靈敏、準(zhǔn)確、高通量，對(duì)液態(tài)食品的貨架期、倉(cāng)儲(chǔ)、保質(zhì)期、出口等順利進(jìn)行提供了高效的技術(shù)平臺(tái)［27-29］。而在現(xiàn)實(shí)生活中，食品的生產(chǎn)、運(yùn)輸、消費(fèi)過(guò)程均存在微生物污染的可能，食源性疾病是食品安全中最突出的問(wèn)題，流式細(xì)胞儀已成為檢測(cè)霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原菌的有力手段［30-32］。

2.3應(yīng)用于食品中微生物的在線檢測(cè)流式細(xì)胞儀能夠檢測(cè)食品中目標(biāo)微生物的數(shù)量，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，因此滿足了批量樣品的在線檢測(cè)需求。有人設(shè)計(jì)了一種低通量的流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)，能夠?qū)崟r(shí)、在線監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器中菌體生長(zhǎng)的變化過(guò)程。與其他熒光檢測(cè)方法相比，只有流式細(xì)胞儀可以從大量弱熒光信號(hào)的菌體中辨別出少量熒光信號(hào)強(qiáng)的菌體，由于流式細(xì)胞儀能夠提供精確、可靠的檢測(cè)結(jié)果，因此可以從中選擇穩(wěn)定的高產(chǎn)量理想菌株［33-35］。

3　結(jié)論與展望

流式細(xì)胞儀的使用解決了一些傳統(tǒng)檢測(cè)手段的缺點(diǎn)，比如檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法大批量檢測(cè)樣本［36-37］，流式細(xì)胞儀能夠保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能不被破壞，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選，目前已成為食品中微生物質(zhì)量檢測(cè)的一種有力手段。然而，流式細(xì)胞儀在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用僅是冰山一角［38-42］，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的功能將越來(lái)越強(qiáng)大，逐步向儀器小型化，操作自動(dòng)化的方向發(fā)展。

［1］WOO J， BAUMANN A， ARGUELLO V. Recent advancements of flow cytometry∶ new applications in hematology and oncology［J］. Expert Rev Mol Diagn， 2014， 14（1）∶ 67-81.

［2］出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法 第2部分∶大腸桿菌O157［S］. 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn). SN/T 2754. 2-2011.

［3］食品和動(dòng)物飼料大腸桿菌O157的檢測(cè)方法 免疫磁珠法［S］. 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn). SN/T 1059. 5-2006.

［4］禽蛋中沙門氏菌的檢測(cè)熒光PCR法［S］. 地方標(biāo)準(zhǔn). DB34/T 1539-2011.

［5］食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn)酶聯(lián)免疫法［S］. 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 22429-2008.

［6］ 飼料中凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌的微生物學(xué)檢驗(yàn) Baird-parker瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法［S］. 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 23743-2009.

［7］交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法 第3部分∶大腸桿菌O157∶H7. 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).SN/T 3567. 3-2015.

［8］出口食品中金黃色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法［S］. 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn). SN/T 4453-2016.

［9］進(jìn)出口食品中金黃色葡萄球菌腸毒素A檢測(cè)方法電泳和免疫印跡法［S］. 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn). SN/T 2416-2010.

［10］飼料中沙門氏菌的測(cè)定免疫色譜反應(yīng)法［S］. 地方標(biāo)準(zhǔn).DB34/T 816-2008.

［11］周麗， 周振英. 流式細(xì)胞儀研制的技術(shù)進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用， 2003， 15（1）∶ 11～17.

［12］張藝. 流式細(xì)胞儀構(gòu)成與工作原理［J］. 醫(yī)療設(shè)備信息， 2005，20（8）∶25-26.

［13］PATKARA， VIJAYASANKARANN， URRYDW， etal. Flow cytometry as a useful tool for process development∶rapid evaluation of expression systems［J］. J Biotechnol， 2002， 93（3）∶ 217-229.

［14］趙書濤， 武曉東， 王策等. 流式細(xì)胞儀的原理、應(yīng)用及最新進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2011， 11（22） ∶4378－4381.

［15］宋平根， 李素文. 流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用［M］. 北京∶北京師范大學(xué)出版社， 1992∶ 7-16.

［16］謝小梅， 許楊. 流式細(xì)胞術(shù)［J］. 中國(guó)生物工程雜志， 2003， 23（9）∶100-104.

［17］李華， ?，? 流式細(xì)胞儀工作原理與臨床應(yīng)用［J］. 中國(guó)醫(yī)療器械信息， 2011， 17（5）∶ 37-45

［18］徐濱， 林波海， 吳維等. 新型多功能流式細(xì)胞儀的研制［J］. 生物物理學(xué)報(bào)， 1998（14）3∶ 558-564.

［19］SCHENK M，RAFFELLINI S， GUERRERO S， et al. Inactivation of Escherichia coli， Listeria innocua and Saccharomyces cerevisiae by UV-C light∶ Study of cell injury by flow cytometry［J］. Food Sci Technol， 2011，44（1）∶ 191-198.

［20］黃瑩瑩. 流式細(xì)胞分選術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展［J］. 科技視界， 2013（3）∶173.

［21］李文華， 胡茂志， 嚴(yán)秋香等. 流式細(xì)胞術(shù)在營(yíng)養(yǎng)和食品衛(wèi)生評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（11）∶279-281.

［22］BROGER T， ODERMATT R P， HUBER P， et al. Real-time on-line flow cytometry for bioprocess monitoring［J］. J Biotechnol， 2011， 154（ 4） ∶240-247.

［23］鄭海萍， 李艷輝. 流式細(xì)胞儀的原理及應(yīng)用［J］. 醫(yī)療器械， 2003，16（3）∶ 286.

［24］王寧， 劉寧. 流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)生乳中細(xì)菌總數(shù)［J］. 食品工業(yè)科技， 2007， 28（9）∶ 197-200.

［25］THUSITHA S GUNASEKERA， PAUL V ATTFIELD， DUNCAN A VEAL. A Flow Cytometry Method for Rapid Detection and Enumeration of Total Bacteria in Milk［J］. Applied and Environmental Micorbiology，2005， 66（3）∶ 1228-1232.

［26］肖安風(fēng)， 周祥山， 周利等. 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)畢赤酵母的細(xì)胞活性［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2006， 33（6）∶ 22-26.

［27］劉道亮， 胡連霞， 趙占民. 流式細(xì)胞技術(shù)快速檢測(cè)果汁中的霉菌、酵母菌［J］. 食品工業(yè)科技， 2011， 32（03）∶ 387-391.

［28］潘洛安， 張利華， 張經(jīng). 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定水體異養(yǎng)細(xì)菌［J］.海洋環(huán)境科學(xué)， 2005， 24（1）∶ 54-58.

［29］劉新星， 霍轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)， 云慧等. 流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報(bào)， 2014， 41（1）∶ 161-168.

［30］秦迪嵐. 熒光納米標(biāo)記與編碼技術(shù)用于幾種重要病原菌檢測(cè)的研究［D］. 長(zhǎng)沙∶湖南大學(xué)， 2008.

［31］付亮， 龍軍， 袁小澎. 流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的研究［J］. 廣東醫(yī)學(xué)， 2011， 32（4）∶ 626-631.

［32］杭堯. 流式細(xì)胞儀在豬鏈球菌黏附細(xì)胞研究中的應(yīng)用［D］. 武漢∶華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

［33］耿慧霞， 王來(lái)， 王強(qiáng). 流式細(xì)胞儀在生物學(xué)中的應(yīng)用［J］. 生物學(xué)雜志， 2005， 22（4）∶ 44-51.

［34］葉雷， 陳慶森， 閻亞麗等. 流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)直投式發(fā)酵劑菌體活力［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（10） ∶139-144.

［35］WANG Y， HAMMES F， DE ROY K， et al. Past， present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology［J］. Trends Biotechnol， 2010， 28（ 8） ∶ 416-424.

［36］吳慧清， 吳清平. 生物發(fā)光檢測(cè)法和國(guó)際法檢測(cè)樣品中活菌總數(shù)的比較研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2004， 25（4）∶134-136.

［37］詹乾鋼. EPICSXL流式細(xì)胞儀的基本原理及臨床應(yīng)用［J］. 醫(yī)療裝備， 2002， 15（7）∶ 3-5.

［38］徐勇， 霍梅. 免疫磁珠分離及流式細(xì)胞儀分選純化外周血CD34+ /CD90+干細(xì)胞［J］. 臨床檢驗(yàn)雜志， 2004， 22（4）∶246-248.

［39］張盈華. 流式細(xì)胞儀在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］. 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志. 1997（20）4∶ 203-204.

［40］張俊娥， 鄧秀新. 采用流式細(xì)胞儀分析柑橘愈傷組織的細(xì)胞周期［J］. 果樹學(xué)報(bào)， 2005， 22（6）∶741-743.

［41］朱道圩， 楊宵， 郅玉寶等. 用流式細(xì)胞儀鑒定中華獼猴桃的多倍體［J］. 植物生物學(xué)通訊， 2007， 43（5）∶905-908.

［42］何麗云， 崔巍， 范吉平等. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺氧/缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究［J］. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志， 2000， 6（11）∶ 39-42.

S811.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

1007-1733（2016）08-0082-03

2011國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)-細(xì)胞周期分析與因子檢測(cè)任務(wù)（2011YQ03013408）

2016-05-11）