Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

鄒建華1，付　娟1，陳　喆2（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006）

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中藥砷劑活性代謝產(chǎn)物單甲基亞砷酸的生物學(xué)效應(yīng)研究進(jìn)展

Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

鄒建華1，付娟1，陳喆2
（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006）

關(guān)鍵詞三氧化二砷；單甲基亞砷酸；生物學(xué)效應(yīng)；研究進(jìn)展

三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）俗稱砒霜，始載于宋《開寶本草》，其味苦酸，有毒，歸脾、肺、肝經(jīng)，具有蝕瘡、去腐、殺蟲、劫痰定喘、劫瘧之功。砷是一種廣泛存在于人類生活環(huán)境中的致癌物質(zhì)［1］，與包括皮膚癌、肺癌和膀胱癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤相關(guān)。近年來(lái)，As2O3被成功應(yīng)用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）［2］。此外，砷可以誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡。單甲基亞砷酸（MMAIII）是As2O3甲基化的活性代謝產(chǎn)物，大量研究表明MMAIII具有比As2O3更強(qiáng)的生物學(xué)活性［3-4］。低劑量短期作用表現(xiàn)明顯的抗腫瘤作用，長(zhǎng)期慢性暴露在MMAIII下導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，綜述As2O3代謝產(chǎn)物MMAIII的急性和慢性生物學(xué)效應(yīng)。

1三氧化二砷體內(nèi)代謝過(guò)程

砷是一種廣泛存在于人類生活環(huán)境中的致癌物質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)As2O3在體內(nèi)代謝有兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程：①五價(jià)砷被還原。五價(jià)砷被還原為三價(jià)狀態(tài)，主要通過(guò)砷酸鹽還原酶催化的酶促反應(yīng)和谷胱甘肽催化的非酶促反應(yīng)兩種途徑完成。②三價(jià)砷的甲基化。被還原為三價(jià)狀態(tài)的砷在肝臟甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成單甲基砷酸（MMAV），在MMAV還原酶的作用下MMAV被還原為單甲基亞砷酸（MMAIII），MMAIII可以進(jìn)一步被甲基化為二甲基亞砷酸（DMAIII）。在上述過(guò)程中，谷胱甘肽（GSH）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）發(fā)揮了重要的作用［5-6］。

2 MMAIII的急性生物學(xué)效應(yīng)

2.1 MMAIII誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）在細(xì)胞凋亡、生存、增殖和分化中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［7］。PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜蛋白，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)PERK自身磷酸化為PPERK而被激活，進(jìn)而通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子4 （activating transcription factor-4，ATF4）及下游重要的凋亡啟動(dòng)蛋白CHOP的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8-9］。有研究發(fā)現(xiàn)15 μM隱丹參酮（CPT）分別聯(lián)合1 μM MMAIII和1 μM As2O3協(xié)同作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞，24 h后MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMAIII聯(lián)合CPT協(xié)同抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞效果明顯優(yōu)于As2O3聯(lián)合CPT。Western blot檢測(cè)MMAIII聯(lián)合CPT協(xié)同作用1 h后P-PERK蛋白表達(dá)顯著增高，并且呈時(shí)間依賴性促進(jìn)下游蛋白ATF4及CHOP的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax、Bak的活化和細(xì)胞色素C的釋放，引起MCF-7細(xì)胞凋亡［10］。

2.2 MMAIII通過(guò)泛素化蛋白酶系統(tǒng)誘導(dǎo)P53蛋白降解引起細(xì)胞凋亡

P53是一種重要的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物參與細(xì)胞周期調(diào)控［11-12］。大量研究表明，被泛素化的P53蛋白最終在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過(guò)Mdm2泛素化蛋白酶系統(tǒng)降解，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用［12-16］。槲皮素聯(lián)合MMAIII作用正常角質(zhì)HaCaT細(xì)胞后通過(guò)誘導(dǎo)P53蛋白泛素化促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡發(fā)生［17］。

2.3 MMAIII通過(guò)抑制線粒體功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

大量文獻(xiàn)報(bào)道線粒體在凋亡的早期即出現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能的變化，包括通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（permeability transition pore，PTP）的開放和跨膜電位（mitochondrial transmembrane potential，MTP）的耗散。另有研究表明MMAIII影響線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的功能促進(jìn)線粒體內(nèi)膜的Ca2+內(nèi)流，引起線粒體腫脹、細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［18］。已有研究報(bào)道，MMAIII抑制大鼠肝臟RLC16細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物II和IV的活性，誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。

2.4 MMAIII增強(qiáng)血管收縮引起血壓升高

高血壓與中風(fēng)、缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大量流行病學(xué)證據(jù)表明，砷暴露與高血壓在內(nèi)的多種心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。Lim K M等［20］將新鮮分離的大鼠主動(dòng)脈環(huán)暴露于MMAIII（＜0.5 μM）發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血管收縮和升壓反應(yīng)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMAIII呈時(shí)間和濃度依賴性促進(jìn)苯腎上腺素（phenylephrine，PE）對(duì)RhoA的活化，進(jìn)而說(shuō)明MMAIII增強(qiáng)血管收縮引起高血壓與RhoA的激活密切相關(guān)。

2.5 MMAIII誘導(dǎo)血小板凋亡，促進(jìn)血栓形成

磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露在細(xì)胞外膜是激活凝血的重要過(guò)程，也被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)記之一［21］。Bae O N等［22］利用50 μM MMAIII作用人血小板1 h后發(fā)現(xiàn)PS外翻增加，線粒體膜電位改變，凋亡蛋白表達(dá)增多。上述過(guò)程中PS外翻與蛋白質(zhì)的巰基和細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降有關(guān)，加入NAC和L-半胱氨酸等巰基化合物后可以明顯逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)。這意味著蛋白質(zhì)的巰基和ATP的耗竭可能有助于MMAIII誘導(dǎo)PS外翻，誘導(dǎo)血小板凋亡，促進(jìn)血栓形成。

2.6 MMAIII抑制T細(xì)胞的增殖影響免疫系統(tǒng)的功能

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證明,環(huán)境中的亞砷酸鹽會(huì)影響免疫功能，砷通過(guò)飲用水暴露在人群中，對(duì)人體T細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生影響，而免疫抑制與感染、癌癥和其他疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Burchiel S W等［23］將30個(gè)正常捐贈(zèng)者血液中的T細(xì)胞暴露于1 nM～100 nM的MMAIII和NaAsO254 h后發(fā)現(xiàn)100 nM的NaAsO2對(duì)大多數(shù)捐贈(zèng)者的T細(xì)胞沒有明顯的增殖抑制作用，但是100 nM MMAIII能明顯抑制所有捐贈(zèng)者T細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響捐贈(zèng)者的免疫功能。

2.7 MMAIII急性暴露后抑制膽固醇的合成

膽固醇是人類細(xì)胞膜的重要組成部分，膽固醇合成不足可以影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。Guo L等［24］利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)MMAIII作用人類皮膚成纖維細(xì)胞GM00637后蛋白組學(xué)的變化情況，發(fā)現(xiàn)MMAIII可以下調(diào)膽固醇合成酶，使內(nèi)源性膽固醇的合成減少。

3 MMAIII的慢性生物學(xué)效應(yīng)

3.1 MMAIII長(zhǎng)期暴露活化COX-2，促進(jìn)膀胱細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變

COX-2是負(fù)責(zé)類花生酸合成的誘導(dǎo)酶，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮調(diào)控［25-26］。Src、PI3K、COX-1、COX-2信號(hào)通路與MMAIII誘導(dǎo)的UROtsa細(xì)胞非貼壁性生長(zhǎng)密切相關(guān)。提示COX-2或COX-2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MMAIII誘導(dǎo)膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。

3.2 MMAIII長(zhǎng)期暴露促進(jìn)炎癥相關(guān)因子釋放，引起炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)常被認(rèn)為是一種對(duì)機(jī)體有害的生物學(xué)現(xiàn)象［27］，Virchow最初觀察到被特定化學(xué)刺激物引發(fā)的組織炎癥與細(xì)胞增生程度增強(qiáng)有關(guān)，提出慢性炎癥與癌變之間存在關(guān)聯(lián)［28］。細(xì)胞壞死時(shí)細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)釋放到鄰近細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)。大量文獻(xiàn)表明，MMAIII可以促進(jìn)多種炎癥因子的釋放，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道50 nM MMAIII作用于UROtsa細(xì)胞3個(gè)月后可以刺激TNFα、IL-6、IL-8等炎癥因子的釋放，引起炎癥反應(yīng)［29］。UROtsa細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在MMAIII中發(fā)現(xiàn)炎癥相關(guān)因子（IL-1β，IL-6 and IL-8）分泌增多，其中IL-8尤為明顯。IL-8可以進(jìn)一步激活NFKβ、AP1/cjun、ERK2、STAT3等炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，基因沉默IL-8后可以逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象［30］。上述結(jié)果表明IL-8介導(dǎo)了MMAIII促進(jìn)UROtsa細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

3.3 MMAIII長(zhǎng)期暴露后影響DNA修復(fù)功能

細(xì)胞的惡性變與DNA的損傷有著密切的關(guān)系，DNA損傷修復(fù)有多種酶參與，PARP-1是參與DNA堿基切除修復(fù)啟動(dòng)的關(guān)鍵酶。Wnek S M等［31］發(fā)現(xiàn)MMAIII連續(xù)處理UROtsa細(xì)胞8 w、12 w后可顯著增加DNA單鏈的斷裂，斷裂的DNA可以迅速激活PARP-1，PARP-1的修復(fù)作用主要依賴于其N末端與DNA結(jié)合區(qū)域的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。MMAIII可以競(jìng)爭(zhēng)性與兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而抑制PARP-1蛋白功能，引起DNA損傷，促進(jìn)UROtsa細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

4問題與展望

目前，小分子藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于生物和醫(yī)學(xué)具有重大意義，研究小分子化合物與蛋白質(zhì)分子間的相互作用已成為熱點(diǎn)。MMAIII作為As2O3的小分子甲基化代謝產(chǎn)物，具有比As2O3更強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)，但其分子學(xué)作用機(jī)制仍不明確。大量體外實(shí)驗(yàn)表明MMAIII抗腫瘤效果明顯優(yōu)于As2O3，且其毒副反應(yīng)更小。盡管As2O3成功用于臨床治療APL等多種惡性腫瘤，但MMAIII的臨床應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道甚少。闡明MMAIII分子作用機(jī)制為中藥砷劑的深入研究，指導(dǎo)臨床治療用藥是我們目前亟待解決的問題。隨著對(duì)中藥砷劑研究的不斷深入，人們對(duì)其活性代謝產(chǎn)物MMAIII的認(rèn)識(shí)不斷加深，這為其臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供了理論依據(jù)，MMAIII具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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（編輯：張世霞）

中圖分類號(hào)：R282.76

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-0258（2016）02-0073-03

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金（81473389）

［作者簡(jiǎn)介］鄒建華，在讀碩士，E-mail：2836088573@qq.com

［通訊作者］陳喆，副研究員，研究生導(dǎo)師，E-mail：alexisczh@sohu.com