黃 婷，楊桂玲

(1. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科；2. 江西省血液重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3. 中國(guó)人民解放軍第九四醫(yī)院，江西南昌 330006)

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MicroRNA-21在急性髓系白血病骨髓細(xì)胞中的異常表達(dá)及意義

黃 婷1,3，楊桂玲1,2

(1. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科；2. 江西省血液重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3. 中國(guó)人民解放軍第九四醫(yī)院，江西南昌 330006)

目的 分析急性髓系白血病(AML)患者骨髓細(xì)胞中miR-21的表達(dá)情況及其在白血病發(fā)生發(fā)展中的可能作用及臨床意義。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)40例初治AML患者、22例完全緩解期AML(AML-CR)患者、13例難治復(fù)發(fā)患者、20例非血液腫瘤患者及健康人骨髓中miR-21的表達(dá)水平，并分析AML患者miR-21的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果 miR-21在AML中的表達(dá)是上調(diào)的，初治組、完全緩解組及難治復(fù)發(fā)組miR-21的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；完全緩解組miR-21的表達(dá)量較初治組有所下降(P<0.05)；難治復(fù)發(fā)組miR-21的表達(dá)量高于初治組，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；初治AML miR-21表達(dá)水平與骨髓原始幼稚細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，與外周血白細(xì)胞數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量以及年齡、性別、染色體異常等均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 miR-21在急性髓系白血病患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，可能在白血病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并有望成為白血病診斷的新的分子標(biāo)志物。

急性白血病；miR-21；骨髓細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；分子標(biāo)志物

MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約18～26個(gè)核苷酸的、參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶基因mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’-UTRs)，抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在正常血細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要作用，并參與細(xì)胞增殖與凋亡、造血生成等生物學(xué)過程，推測(cè)miRNAs的異常表達(dá)可能與血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。miR-21是一個(gè)典型的oncomiR，在肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)水平與疾病分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。研究報(bào)道，miR-21在白血病K562細(xì)胞中的表達(dá)量增高，且靶向miR-21的反義核酸可使白血病K562細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制并誘導(dǎo)其凋亡[5-7]。但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于miR-21與白血病的關(guān)系多由體外實(shí)驗(yàn)得出，急性白血病患者骨髓中miR-21表達(dá)情況及作用機(jī)制尚不明確。本研究通過檢測(cè)急性髓系白血病(AML)患者骨髓細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，并與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，探討其在白血病發(fā)生發(fā)展中的可能作用，為將來白血病的臨床診斷及治療提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014年2月～2014年11月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治并診斷明確的AML患者骨髓細(xì)胞75例，其中男39例，女36例，年齡14～75歲，中位年齡46.8歲。包括初治患者40例，難治復(fù)發(fā)患者13例，完全緩解期(complete remission, CR)患者22例。所有患者均符合FAB國(guó)際分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，且同意使用其骨髓標(biāo)本用于研究并簽署知情同意書。20例健康骨髓捐獻(xiàn)者和非惡性血液病患者骨髓作為正常對(duì)照組。本課題所涉及的AML的治療方案與療效判定參照張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第三版。

1.2 標(biāo)本采集及骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)的分離

按常規(guī)無菌操作行骨髓穿刺術(shù)，取患者及對(duì)照者新鮮骨髓液2～4 mL，放入EDTA抗凝管中，用PBS稀釋，淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)密度梯度離心法分離獲得BMMNC，適量紅細(xì)胞裂解液去除殘留的紅細(xì)胞，PBS洗滌1次后留取沉淀(單個(gè)核細(xì)胞)，加入1 mL Trizol，振蕩混勻，充分裂解細(xì)胞，直接提取總RNA或于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA的提取及鑒定

按Trizol(美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品)試劑產(chǎn)品說明書進(jìn)行BMMNC總RNA提取，DEPC水溶解，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外線分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度、純度，A260/A280值為1.8～2.0者為合格樣品。

1.4 miR-21/U6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

按TaKaRa公司cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR718說明，進(jìn)行多聚A尾逆轉(zhuǎn)錄過程。反應(yīng)體系為：2×miRNA Reaction buffer Mix 10 μL、miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL、RNase Freed H2O 4 μL、總RNA 2 μL，Total 20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 60 min；85 ℃ 5 s。逆轉(zhuǎn)錄后cDNA中用RNase free dd H2O補(bǔ)到60 μL，-20 ℃保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)

TaKaRa公司試劑盒RR718已提供PCR通用引物和成品內(nèi)參U6，應(yīng)用SYBR Primer EXTaqⅡ進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，由美國(guó)ABI公司的7300型Real Time PCR擴(kuò)增儀完成。同一樣本分別進(jìn)行miR-21和U6的擴(kuò)增反應(yīng)，并設(shè)3個(gè)復(fù)孔及空白對(duì)照(不加cDNA模板)。miR-21正義引物序列：5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′；反應(yīng)體系為：SYBR Primer EXTaqⅡ(2×)12.5 μL、通用正義引物1 μL、正義引物1 μL、ROX Reference Dye(50×)0.5 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 2 μL，Total 25 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳判定PCR產(chǎn)物。

1.6 miR-21相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算

讀取miR-21和U6的Ct值，用公式2-△Ct計(jì)算目的基因miR-21的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。連續(xù)型變量資料不符合正態(tài)分布，各組數(shù)據(jù)間差異的比較采用Mann-WhitheyU檢驗(yàn)；用中位數(shù)和四分位數(shù)表示非正態(tài)計(jì)量資料，采用Spearman秩相關(guān)法進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-21的擴(kuò)增結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效果好，所有患者骨髓標(biāo)本所測(cè)miR-21及U6內(nèi)參的CT值均在30以下，溶解曲線呈單峰，無非特異性擴(kuò)增(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

電泳可見miR-21產(chǎn)物、U6產(chǎn)物在70 bp左右(圖2)，擴(kuò)增產(chǎn)物未見明顯雜帶，符合要求。

2.3 各組樣本miR-21的表達(dá)水平

采用Mann-WhitheyU檢驗(yàn)的方法進(jìn)行各組間的比較。各組miR-21表達(dá)水平的中位數(shù)及四分位數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，miR-21在急性白血病中的表達(dá)是上調(diào)的，初治組、完全緩解組及難治復(fù)發(fā)組的表達(dá)水平均高于對(duì)照組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)合圖3可以

圖1 miR-21及U6的擴(kuò)增曲線及熔解曲線

Fig.1 Amplification curve and melting curve of miR-21 and U6
A、C分別為miR-21的擴(kuò)增曲線及熔解曲線：B、D分別為U6的擴(kuò)增曲線及熔解曲線。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

Fig.2 The electrophoretic results of PCR products
M：marker; 1：U6；2：空白對(duì)照；3：完全緩解組miR-21；4：難治復(fù)發(fā)組miR-21；5：初治組miR-21。

表1 各組樣本miR-21的表達(dá)水平與比較

Tab.1 Comparison of the expression of miR-21 in all groups

組別例數(shù)miR-21相對(duì)表達(dá)量(四分位數(shù))25th50th75thP值初治組400.6381.0162.532<0.05*完全緩解組220.6050.7891.011<0.05**難治復(fù)發(fā)組131.0001.9963.177<0.01△正常對(duì)照組200.1810.4870.954

與完全緩解組、正常對(duì)照組比較，*P均<0.05；與其他3組比較，**P均<0.05；與完全緩解組、正常對(duì)照組比較，△P均<0.01。

發(fā)現(xiàn)化療緩解組miR-21的表達(dá)量較初治患者有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；難治復(fù)發(fā)組miR-21的表達(dá)量高于初治組，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 初治AML患者miR-21表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

初治AML患者miR-21表達(dá)水平與骨髓原始幼稚細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，與患者外周血白細(xì)胞數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

圖3 miR-21在各分組之間的表達(dá)水平

Fig.3 The expression of miR-21 in each group

表2 初治AML患者miR-21的表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

Tab.2 The correlation between the level of miR-21 and clinical indicators in initial AML patients

臨床指標(biāo)四分位數(shù)25th50th75thSpearman相關(guān)系數(shù)P值骨髓原始幼稚細(xì)胞53.1873.2582.50.3610.022白細(xì)胞數(shù)3.0311.3941.51-0.0850.601血紅蛋白含量537081-0.1730.285血小板計(jì)數(shù)2837600.0620.703

2.5 初治AML患者miR-21表達(dá)與年齡、性別及染色體核型的相關(guān)性

將初治AML患者按性別及年齡55歲為界各分為兩組， 采用Mann-WhitheyU檢驗(yàn)的方法進(jìn)行各組間miR-21表達(dá)的比較，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)初治AML患者miR-21表達(dá)與年齡、性別存在相關(guān)性，miR-21在各組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在40例初治AML患者中，34例獲得了可供分析的染色體核型。按照SWOG分型標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)后差組4例，包括2例t(6;9)，1例-5，1例復(fù)雜核型；預(yù)后良好組13例，包括7例t(15;17)，4例t(8;21)，2例inv(16)；預(yù)后中等組17例，包括正常核型和其他染色體異常，采用Mann-WhitheyU檢驗(yàn)的方法進(jìn)行3組間miR-21表達(dá)的比較，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)初治AML患者miR-21表達(dá)與染色體預(yù)后分組存在相關(guān)性，miR-21在3組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

3 討 論

白血病是血液系統(tǒng)最常見的惡性疾病，隨著人口老齡化，其發(fā)病率逐年升高。急性白血病(AL)起病急、自然病程短，嚴(yán)重威脅著人類的生存和健康，雖然隨著新型化療藥物的不斷出現(xiàn)及干細(xì)胞移植技術(shù)的不斷進(jìn)步，其療效有了顯著提高，但部分AL治療反應(yīng)差，復(fù)發(fā)及繼發(fā)耐藥仍是目前白血病研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)miRNA的研究進(jìn)展很快。文獻(xiàn)證實(shí)miRNAs參與造血干細(xì)胞的成熟分化，其差異性表達(dá)與血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可通過調(diào)控某些癌基因或抑癌基因參與惡性血液病的發(fā)生[8]。miR-21是一個(gè)典型的致癌性miRNA，被證實(shí)在多種實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)，其通過調(diào)控多個(gè)抑癌基因和凋亡相關(guān)分子，如PTEN、PDCD4、RECK、Tipe2等促進(jìn)腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移[9-12]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種與白血病相關(guān)的microRNA[13-14]，其中關(guān)于miR-21的研究逐漸增多。研究報(bào)道，miR-21在白血病細(xì)胞株K562中的表達(dá)水平異常增高，同時(shí)，設(shè)計(jì)靶向miR-21的反義寡核苷酸可有效抑制白血病K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，并顯著促進(jìn)其凋亡，說明miR-21參與白血病的發(fā)生發(fā)展，并可作為治療白血病的一個(gè)作用靶點(diǎn)[5-6]。吳共發(fā)等[7]通過轉(zhuǎn)染miR-21抑制物抑制miR-21表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和增殖變化，表明抑制miR-21表達(dá)不僅能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和增加白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，還能抑制白血病K562細(xì)胞的遷移和增殖能力，并初步探討其中機(jī)制與miR-21調(diào)節(jié)抑癌基因PTEN的表達(dá)有關(guān)。BAI等[15]亦證明，miR-21可通過抑制PTEN表達(dá)，激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞對(duì)柔紅霉素(daunorubicin, DNR)的耐藥，而抑制miR-21則可增強(qiáng)DNR對(duì)K562細(xì)胞的毒性作用。綜上所述，miR-21可能成為白血病診斷的心得分子標(biāo)志物和治療及預(yù)后評(píng)估的分子靶點(diǎn)。

表3 初治AML患者miR-21的表達(dá)與年齡、性別及染色體核型的相關(guān)性

Tab.3 The correlation of the level of miR-21 with the age, gender and karyotype in initial AML patients

臨床指標(biāo)例數(shù)miR-21中位表達(dá)量P(各組間比較)性別 男210.966 女191.467>0.05年齡(歲) ≥55110.711 <55291.189>0.05SWOG核型分型 預(yù)后良好130.983 預(yù)后中等170.924 預(yù)后差41.226>0.05

鑒于白血病依賴于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子遺傳學(xué)等的診斷方法都需完善骨髓穿刺，骨髓標(biāo)本易獲得且較易被患者接受，檢測(cè)AL患者骨髓中miRNA的表達(dá)，將成為白血病診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的有利手段。目前，關(guān)于AL患者骨髓細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平檢測(cè)及與臨床指標(biāo)相關(guān)性的研究尚未見報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)AML患者骨髓細(xì)胞中miR-21的表達(dá)情況及與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果表明不同分組間miR-21的表達(dá)水平有顯著差異。初治組、完全緩解組及難治復(fù)發(fā)組的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)初治AML患者化療前后miR-21表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn)，化療后獲得CR的患者miR-21的表達(dá)量較初治患者有所下降，但仍高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；難治復(fù)發(fā)組miR-21的表達(dá)量高于初治組，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行研究。這些結(jié)果表明，miR-21不僅在AML中普遍存在過表達(dá)，且其表達(dá)水平與疾病狀態(tài)有關(guān)，提示miR-21的過表達(dá)參與了AML的發(fā)生發(fā)展過程。

ROSSI等[16]報(bào)道，miR-21在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中過表達(dá)并與CLL患者生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，可用于染色體17p缺失的CLL患者早期存活率分層。另有研究表明miR-21的表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤(MM)瘤細(xì)胞負(fù)荷呈正相關(guān)，并通過相關(guān)性分析證實(shí)miR-21與MM的發(fā)生發(fā)展和疾病預(yù)后有密切關(guān)系，可作為診斷MM的新標(biāo)志物及判斷MM患者預(yù)后不良指標(biāo)之一[17-18]。本實(shí)驗(yàn)通過分析miR-21表達(dá)與一些臨床指標(biāo)的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)水平與骨髓原始幼稚細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，而與患者年齡、性別、外周血白細(xì)胞數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量等因素?zé)o明顯相關(guān)。目前，認(rèn)為在AML的預(yù)后因素中，最有意義的是染色體的異常。本實(shí)驗(yàn)分析了miR-21表達(dá)水平與SWOG的染色體預(yù)后之間的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)初治AML miR-21表達(dá)與染色體預(yù)后分組存在相關(guān)性。由于本實(shí)驗(yàn)尚有不足，限于時(shí)間、標(biāo)本數(shù)量等限制，且實(shí)驗(yàn)方法單一，在AL的發(fā)病中，miR-21是作為一個(gè)獨(dú)立的影響因素來發(fā)揮作用，還是聯(lián)合其他致病因素一同作用的，有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。

本研究初步證實(shí)，miR-21與AML的疾病狀態(tài)、骨髓原始幼稚細(xì)胞等相關(guān)，參與AML的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后，可能成為白血病診斷的新的分子標(biāo)志物和治療及預(yù)后評(píng)估的分子靶點(diǎn)。本研究可為將來探索白血病的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)和新思路。

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(編輯 卓選鵬)

Differential expression of miR-21 in bone marrow cells of acute myeloid leukemia patients and its significance

HUANG Ting1,3,YANG Gui-ling1,2

(1. Department of Hematology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University;2. Key Laboratory of Hematology in Jiangxi Province;3. No.94 Hospital of PLA, Nanchang 330006, China)

Objective To investigate the expression level of miR-21 in bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) of patients with acute myeloid leukemia (AML) and explore its effect and clinical significance in the pathogenesis and development of AML. Methods Real-time quantitative reverse transcription PCR(qRT-PCR) was used to examine the expression level of miR-21 in 75 AML patients, including 40 patients with newly diagnosed AML, 22 patients AML with complete remission (CR), 13 refractory AML patients and 20 cases of normal bone marrow. We analyzed the relationship between miR-21 expression and clinical features of the patients. Results The expression of miR-21 was upregulated in AML, and miR-21 expression was significantly higher in initial treatment group, CR group and refractory recurrent group than in control group (P<0.05). The expression of miR-21 in CR group was lower than in the initial treatment group (P<0.05); it was higher in refractory recurrent group than in the initial treatment group, but without significant difference (P>0.05). The expression of miR-21 after initial treatment had a positive correlation with the number of original na?ve bone marrow cells (P<0.05), but no obvious correlation with the patients’ peripheral blood leukocyte count, platelet count, hemoglobin content, age, gender, or chromosome abnormality (P>0.05). Conclusion miR-21 is excessively expressed in bone marrow cells of AML and is correlated with patients’ body tumor load, indicating that miR-21 may be involved in the development of AML and can be used as a new molecular marker to guide clinical treatment.

acute leukemia; miR-21; bone marrow cells; real-time RT-PCR; molecular marker

2015-03-18

2015-11-05

楊桂玲. E- mail:935723981@qq.com

R733.7

A

10.7652/jdyxb201601019

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1721.026.html(2015-12-09)