王謹(jǐn)慧, 靳子明, 李茂星
(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅蘭州730020;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科,全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730050)
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大孔吸附樹脂富集純化桃兒七中的鬼臼毒素
王謹(jǐn)慧1, 靳子明1, 李茂星2*
(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅蘭州730020;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科,全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730050)
摘要:目的 建立桃兒七中鬼臼毒素的大孔吸附樹脂富集純化工藝。方法 HPLC法測(cè)定樣品中鬼臼毒素的含有量,比較12種不同廠家、型號(hào)的大孔樹脂對(duì)桃兒七水提取物中鬼臼毒素的吸附與解吸附條件,優(yōu)選最佳的純化工藝。結(jié)果 HPD-100型大孔吸附樹脂對(duì)桃兒七水提取物中鬼臼毒素具有良好的吸附能力,30%乙醇能大量洗脫除去雜質(zhì),60%乙醇能解吸附鬼臼毒素,95%乙醇能再生大孔吸附樹脂柱。富集后,鬼臼毒素的含有量達(dá)到28.46%,遠(yuǎn)高于水提取物中的1.58%。結(jié)論 采用HPD-100型大孔吸附樹脂能從桃兒七水提取物中快速富集提取鬼臼毒素,而且樹脂重復(fù)利用度高。
關(guān)鍵詞:桃兒七;鬼臼毒素;大孔吸附樹脂;富集純化
鬼臼毒素(Podophy11otoxin)及其衍生物鬼臼乙叉苷(Etoposide,VP-16)和鬼臼噻吩苷(Teniposide,VM-26)具有良好的抗癌活性,臨床廣泛用于治療淋巴瘤、急性白血病、睪丸癌、小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌和腦癌等[1-2]。鬼臼毒素主要來源于小檗科桃兒七屬植物桃兒七Sinopodophyllum hexandrum(Roy1e)Ying的果實(shí)、根及根狀莖[3],隨著鬼臼毒素需求量的增加,對(duì)其提取和合成等研究顯得尤為重要。目前,對(duì)鬼臼毒素的提取主要有化學(xué)提取法和柱層析法[4-5],但都存在化學(xué)試劑大量浪費(fèi)、安全性差、效率低和污染嚴(yán)重等問題。
大孔吸附樹脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生簡(jiǎn)單、解吸方便等優(yōu)點(diǎn)[6],已經(jīng)用于植物中黃酮[7]、皂苷[8]、二萜[9]、生物堿[10]等活性單體的分離純化,但應(yīng)用其分離純化木脂素類成分,特別是鬼臼毒素(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過選用大孔吸附樹脂,從桃兒七中分離純化鬼臼毒素,在有效成分損失較小的情況下很好地除去了雜質(zhì),降低了生產(chǎn)成本,提高了產(chǎn)率和質(zhì)量,并具有簡(jiǎn)單、無毒和環(huán)境友好等特點(diǎn)。
圖1 鬼臼毒素(Podophyllotoxin)的化學(xué)結(jié)構(gòu)
Waters高效液相色譜儀,包括600型二元控制系統(tǒng)、996型二極管陣列紫外檢測(cè)器(美國Waters公司);BP210S電子天平(德國Sartorius公司);LSA40、LSA5B型大孔吸附樹脂(西安藍(lán)曉科技有限公司);DA201、D101、DM301、AB8型大孔吸附樹脂(天津海光化工有限公司);YWD03F4、YWD09D、YWD07D型大孔吸附樹脂(滄州遠(yuǎn)威化工有限公司);HPD100、HPD400、HPD600型大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)。桃兒七藥材為市售,經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為桃兒七Sinopodophyllum hexandrum(Roy1e)Ying。鬼臼毒素(Podophy11otoxin)對(duì)照品由蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院田暄教授饋贈(zèng)。
2.1 桃兒七水提物的制備 取桃兒七根及根狀莖250 g,粉碎至20目,加入蒸餾水1 500 mL,煎煮3次,每次1 h,合并煎煮液,放冷,過濾,即得。
2.2 鬼臼毒素含有量的測(cè)定[11-14]采用Waters高效液相色譜儀分析;流動(dòng)相為45%甲醇;體積流量為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為292 nm;數(shù)據(jù)采用Mi11enium 2.10版軟件處理;Symmetry反向C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。
2.3 靜態(tài)吸附測(cè)定 取12種已處理好的樹脂,每種5 mL,加入250 mL小口瓶中,每瓶加入樣品液80 mL和蒸餾水20 mL,25℃下靜置18 h,期間振搖10次。HPLC法測(cè)定各大孔吸附樹脂對(duì)鬼臼毒素的吸附量。將吸收度數(shù)值代入回歸方程,求得剩余含有量,重復(fù)3次。每mL樹脂靜態(tài)吸附比=被樹脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL樹脂,結(jié)果見表1。
表1 12種大孔吸附樹脂靜、動(dòng)態(tài)吸附量的考察
2.4 動(dòng)態(tài)吸附測(cè)定 取12種已處理好的樹脂,每種2 mL,加入玻璃層析柱中,20 mL樣品液以3 mL/min的體積流量反復(fù)上樣3次,100 mL蒸餾水洗脫,收集洗脫液。HPLC法測(cè)定其中鬼臼毒素的含有量,即為未被樹脂吸附的鬼臼毒素量,重復(fù)3次。被樹脂吸附的鬼臼毒素量=上樣總鬼臼毒素量-未被樹脂吸附的鬼臼毒素量;每mL樹脂動(dòng)態(tài)吸附比=被樹脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL樹脂,結(jié)果見表1。
由表可知,各型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)桃兒七水提物中的鬼臼毒素成分都有不同程度的吸附,其中HPD-100型的動(dòng)態(tài)吸附性能最好,LSA-40最差,但差距不大。
2.5 HPD100洗脫體系研究
2.5.1 洗脫溶劑的選擇 考慮到在富集純化過程中,動(dòng)態(tài)吸附能力更加重要,因此根據(jù)上述實(shí)驗(yàn),選取HPD-100型樹脂繼續(xù)研究。取已處理好的HPD100樹脂100 mL,加入玻璃層析柱中,以含1 000 mL樣品液的桃兒七水提物上樣,不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(0%、20%、30%、40%、50%、60%、95%)以1.5 BV/h體積流量解吸附洗脫,然后真空干燥,稱重,重復(fù)3次。HPLC法比較各溶液中的成分,見圖2。并測(cè)定鬼臼毒素的含有量,見表2。
1.鬼臼毒素A.標(biāo)準(zhǔn)品溶液 B.上樣水溶液 C.水洗脫液 D.20%乙醇洗脫液 E.30%乙醇洗脫液 F.40%乙醇洗脫液G.50%乙醇洗脫液 H.60%乙醇洗脫液 I.95%乙醇洗脫液圖2 各溶液中的HPLC成分分析
表2 動(dòng)態(tài)解吸附過程中不同濃度乙醇的洗脫能力
由此可知,以HPD100為吸附劑時(shí),水、10%、20%乙醇只能將水溶性成分洗脫下來;30%乙醇的洗脫液中可見很少量的鬼臼毒素;從40%乙醇開始,大量鬼臼毒素被洗脫下來;到60%乙醇時(shí),可幾乎將鬼臼毒素全部洗脫下來。綜上所述,可用30%乙醇在不損失太多目標(biāo)物的前提下,大量洗脫除去雜質(zhì),然后用60%乙醇對(duì)鬼臼毒素進(jìn)行解吸附,最后用95%乙醇再生大孔吸附樹脂柱。
2.5.2 洗脫體積及洗脫曲線研究 取已處理好的HPD100樹脂20 mL,加入玻璃層析柱中,以400 mL桃兒七水提取樣品液上樣,蒸餾水洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性,計(jì)算洗脫體積。30%乙醇溶液以1.5 BV/h體積流量洗脫,HPLC法動(dòng)態(tài)檢測(cè)至其中鬼臼毒素以峰面積比計(jì)算,不大于0.5%,計(jì)算洗脫體積。60%乙醇溶液以1.5 BV/h體積流量繼續(xù)洗脫,每30 m L收集洗脫液,HPLC法測(cè)定鬼臼毒素含有量,真空干燥,稱重,重復(fù)3次。
由表3、圖3可知,20倍柱體積蒸餾水可以洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性。30%乙醇洗脫溶液在不大于10倍柱體積時(shí),不會(huì)損失太多目標(biāo)物;9倍柱體積的60%乙醇溶液可以將大部分目標(biāo)物解吸附;15倍柱體積的60%乙醇溶液可以將目標(biāo)物完全解吸附。以HPD-100型大孔吸附樹脂柱處理前后的總固物和鬼臼毒素為指標(biāo),發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂法可以有效去除雜質(zhì),使鬼臼毒素的含有量大幅度提高,而且其回收率達(dá)到90%以上。
表3 XDA-1大孔吸附樹脂對(duì)鬼臼毒素的富集程度
2.5.3 60%乙醇洗脫體積流量研究 在上述研究的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察洗脫體積流量。取400 mL桃兒七水提取樣品液3份,上樣于20 mL已處理好的HPD100樹脂,以20倍柱體積蒸餾水洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性。10倍柱體積30%乙醇溶液洗脫后,再分別以0.5、1.5、3.0 BV/h的60%乙醇溶液洗脫,HPLC法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)至其中的鬼臼毒素以峰面積比計(jì)算,小于0.5%,計(jì)算洗脫體積。結(jié)果表明,以0.5、1.5、3.0 BV/h的60%乙醇溶液洗脫時(shí),其洗脫體積分別為30、15、27倍柱體積,而且1.5 BV/h為最佳洗脫速度。
圖3 鬼臼毒素的洗脫曲線
本實(shí)驗(yàn)研究了12種不同廠家、型號(hào)的大孔吸附樹脂對(duì)桃兒七水提取物中鬼臼毒素的動(dòng)、靜態(tài)吸附與解吸附能力。結(jié)果表明,HPD100型樹脂的吸附能力最好,并且60%乙醇溶液可作為解吸附溶劑,洗脫物中鬼臼毒素的含有量達(dá)28.46%,遠(yuǎn)高于水提取物中的1.58 %。
乙醇及甲醇等有機(jī)溶劑為提取鬼臼毒素的常用溶劑,而苯更能特異性地溶解、純化鬼臼毒素。但是,采用有機(jī)溶劑提取后,不能直接上樣于大孔吸附樹脂,這樣一方面會(huì)增加溶劑回收的工藝流程和成本,而另一方面也會(huì)造成環(huán)境污染和生產(chǎn)中的安全問題。本實(shí)驗(yàn)采用較大量的水加熱提取桃兒七藥材,冷卻后不經(jīng)濃縮,直接上大孔吸附樹脂柱吸附鬼臼毒素類成分,最后以少量乙醇溶液解吸附,獲得較高含有量的鬼臼毒素提取物。該方法避免了大量使用有機(jī)溶劑,而且簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定,適合工業(yè)化生產(chǎn)。
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中圖分類號(hào):R284.2
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B
文章編號(hào):1001-1528(2016)01-0212-04
doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.051
*通信作者:李茂星(1973—),男,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹兴幮滤幯芯颗c開發(fā)。Te1:(0931)8994676,E-mai1:1imaox2005@a1iyun.com
作者簡(jiǎn)介:王謹(jǐn)慧(1977—),女,副主任中藥師,研究方向?yàn)橹兴幣谥婆c制劑工程。Te1:13919917221
收稿日期:2014-11-03