王謹慧， 靳子明， 李茂星

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730020；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州730050）

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大孔吸附樹脂富集純化桃兒七中的鬼臼毒素

王謹慧1， 靳子明1， 李茂星2*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730020；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州730050）

摘要：目的 建立桃兒七中鬼臼毒素的大孔吸附樹脂富集純化工藝。方法 HPLC法測定樣品中鬼臼毒素的含有量，比較12種不同廠家、型號的大孔樹脂對桃兒七水提取物中鬼臼毒素的吸附與解吸附條件，優(yōu)選最佳的純化工藝。結(jié)果 HPD-100型大孔吸附樹脂對桃兒七水提取物中鬼臼毒素具有良好的吸附能力，30％乙醇能大量洗脫除去雜質(zhì)，60％乙醇能解吸附鬼臼毒素，95％乙醇能再生大孔吸附樹脂柱。富集后，鬼臼毒素的含有量達到28.46％，遠高于水提取物中的1.58％。結(jié)論 采用HPD-100型大孔吸附樹脂能從桃兒七水提取物中快速富集提取鬼臼毒素，而且樹脂重復(fù)利用度高。

關(guān)鍵詞：桃兒七；鬼臼毒素；大孔吸附樹脂；富集純化

鬼臼毒素（Podophy11otoxin）及其衍生物鬼臼乙叉苷（Etoposide，VP-16）和鬼臼噻吩苷（Teniposide，VM-26）具有良好的抗癌活性，臨床廣泛用于治療淋巴瘤、急性白血病、睪丸癌、小細胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌和腦癌等［1-2］。鬼臼毒素主要來源于小檗科桃兒七屬植物桃兒七Sinopodophyllum hexandrum（Roy1e）Ying的果實、根及根狀莖［3］，隨著鬼臼毒素需求量的增加，對其提取和合成等研究顯得尤為重要。目前，對鬼臼毒素的提取主要有化學(xué)提取法和柱層析法［4-5］，但都存在化學(xué)試劑大量浪費、安全性差、效率低和污染嚴重等問題。

大孔吸附樹脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生簡單、解吸方便等優(yōu)點［6］，已經(jīng)用于植物中黃酮［7］、皂苷［8］、二萜［9］、生物堿［10］等活性單體的分離純化，但應(yīng)用其分離純化木脂素類成分，特別是鬼臼毒素（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）的研究報道較少。本實驗通過選用大孔吸附樹脂，從桃兒七中分離純化鬼臼毒素，在有效成分損失較小的情況下很好地除去了雜質(zhì)，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)率和質(zhì)量，并具有簡單、無毒和環(huán)境友好等特點。

圖1　鬼臼毒素（Podophyllotoxin）的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜儀，包括600型二元控制系統(tǒng)、996型二極管陣列紫外檢測器（美國Waters公司）；BP210S電子天平（德國Sartorius公司）；LSA40、LSA5B型大孔吸附樹脂（西安藍曉科技有限公司）；DA201、D101、DM301、AB8型大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司）；YWD03F4、YWD09D、YWD07D型大孔吸附樹脂（滄州遠威化工有限公司）；HPD100、HPD400、HPD600型大孔吸附樹脂（滄州寶恩化工有限公司）。桃兒七藥材為市售，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為桃兒七Sinopodophyllum hexandrum（Roy1e）Ying。鬼臼毒素（Podophy11otoxin）對照品由蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院田暄教授饋贈。

2 方法與結(jié)果

2.1 桃兒七水提物的制備 取桃兒七根及根狀莖250 g，粉碎至20目，加入蒸餾水1 500 mL，煎煮3次，每次1 h，合并煎煮液，放冷，過濾，即得。

2.2 鬼臼毒素含有量的測定［11-14］采用Waters高效液相色譜儀分析；流動相為45％甲醇；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為292 nm；數(shù)據(jù)采用Mi11enium 2.10版軟件處理；Symmetry反向C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品為對照。

2.3 靜態(tài)吸附測定 取12種已處理好的樹脂，每種5 mL，加入250 mL小口瓶中，每瓶加入樣品液80 mL和蒸餾水20 mL，25℃下靜置18 h，期間振搖10次。HPLC法測定各大孔吸附樹脂對鬼臼毒素的吸附量。將吸收度數(shù)值代入回歸方程，求得剩余含有量，重復(fù)3次。每mL樹脂靜態(tài)吸附比=被樹脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL樹脂，結(jié)果見表1。

表1　12種大孔吸附樹脂靜、動態(tài)吸附量的考察

2.4 動態(tài)吸附測定 取12種已處理好的樹脂，每種2 mL，加入玻璃層析柱中，20 mL樣品液以3 mL/min的體積流量反復(fù)上樣3次，100 mL蒸餾水洗脫，收集洗脫液。HPLC法測定其中鬼臼毒素的含有量，即為未被樹脂吸附的鬼臼毒素量，重復(fù)3次。被樹脂吸附的鬼臼毒素量=上樣總鬼臼毒素量-未被樹脂吸附的鬼臼毒素量；每mL樹脂動態(tài)吸附比=被樹脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL樹脂，結(jié)果見表1。

由表可知，各型號大孔吸附樹脂對桃兒七水提物中的鬼臼毒素成分都有不同程度的吸附，其中HPD-100型的動態(tài)吸附性能最好，LSA-40最差，但差距不大。

2.5 HPD100洗脫體系研究

2.5.1 洗脫溶劑的選擇 考慮到在富集純化過程中，動態(tài)吸附能力更加重要，因此根據(jù)上述實驗，選取HPD-100型樹脂繼續(xù)研究。取已處理好的HPD100樹脂100 mL，加入玻璃層析柱中，以含1 000 mL樣品液的桃兒七水提物上樣，不同體積分數(shù)的乙醇溶液（0％、20％、30％、40％、50％、60％、95％）以1.5 BV/h體積流量解吸附洗脫，然后真空干燥，稱重，重復(fù)3次。HPLC法比較各溶液中的成分，見圖2。并測定鬼臼毒素的含有量，見表2。

1.鬼臼毒素A.標(biāo)準(zhǔn)品溶液 B.上樣水溶液 C.水洗脫液 D.20％乙醇洗脫液 E.30％乙醇洗脫液 F.40％乙醇洗脫液G.50％乙醇洗脫液 H.60％乙醇洗脫液 I.95％乙醇洗脫液圖2　各溶液中的HPLC成分分析

表2　動態(tài)解吸附過程中不同濃度乙醇的洗脫能力

由此可知，以HPD100為吸附劑時，水、10％、20％乙醇只能將水溶性成分洗脫下來；30％乙醇的洗脫液中可見很少量的鬼臼毒素；從40％乙醇開始，大量鬼臼毒素被洗脫下來；到60％乙醇時，可幾乎將鬼臼毒素全部洗脫下來。綜上所述，可用30％乙醇在不損失太多目標(biāo)物的前提下，大量洗脫除去雜質(zhì)，然后用60％乙醇對鬼臼毒素進行解吸附，最后用95％乙醇再生大孔吸附樹脂柱。

2.5.2 洗脫體積及洗脫曲線研究 取已處理好的HPD100樹脂20 mL，加入玻璃層析柱中，以400 mL桃兒七水提取樣品液上樣，蒸餾水洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性，計算洗脫體積。30％乙醇溶液以1.5 BV/h體積流量洗脫，HPLC法動態(tài)檢測至其中鬼臼毒素以峰面積比計算，不大于0.5％，計算洗脫體積。60％乙醇溶液以1.5 BV/h體積流量繼續(xù)洗脫，每30 m L收集洗脫液，HPLC法測定鬼臼毒素含有量，真空干燥，稱重，重復(fù)3次。

由表3、圖3可知，20倍柱體積蒸餾水可以洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性。30％乙醇洗脫溶液在不大于10倍柱體積時，不會損失太多目標(biāo)物；9倍柱體積的60％乙醇溶液可以將大部分目標(biāo)物解吸附；15倍柱體積的60％乙醇溶液可以將目標(biāo)物完全解吸附。以HPD-100型大孔吸附樹脂柱處理前后的總固物和鬼臼毒素為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂法可以有效去除雜質(zhì)，使鬼臼毒素的含有量大幅度提高，而且其回收率達到90％以上。

表3　XDA-1大孔吸附樹脂對鬼臼毒素的富集程度

2.5.3 60％乙醇洗脫體積流量研究 在上述研究的基礎(chǔ)上，本實驗進一步考察洗脫體積流量。取400 mL桃兒七水提取樣品液3份，上樣于20 mL已處理好的HPD100樹脂，以20倍柱體積蒸餾水洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性。10倍柱體積30％乙醇溶液洗脫后，再分別以0.5、1.5、3.0 BV/h的60％乙醇溶液洗脫，HPLC法動態(tài)監(jiān)測至其中的鬼臼毒素以峰面積比計算，小于0.5％，計算洗脫體積。結(jié)果表明，以0.5、1.5、3.0 BV/h的60％乙醇溶液洗脫時，其洗脫體積分別為30、15、27倍柱體積，而且1.5 BV/h為最佳洗脫速度。

圖3　鬼臼毒素的洗脫曲線

3 討論

本實驗研究了12種不同廠家、型號的大孔吸附樹脂對桃兒七水提取物中鬼臼毒素的動、靜態(tài)吸附與解吸附能力。結(jié)果表明，HPD100型樹脂的吸附能力最好，并且60％乙醇溶液可作為解吸附溶劑，洗脫物中鬼臼毒素的含有量達28.46％，遠高于水提取物中的1.58 ％。

乙醇及甲醇等有機溶劑為提取鬼臼毒素的常用溶劑，而苯更能特異性地溶解、純化鬼臼毒素。但是，采用有機溶劑提取后，不能直接上樣于大孔吸附樹脂，這樣一方面會增加溶劑回收的工藝流程和成本，而另一方面也會造成環(huán)境污染和生產(chǎn)中的安全問題。本實驗采用較大量的水加熱提取桃兒七藥材，冷卻后不經(jīng)濃縮，直接上大孔吸附樹脂柱吸附鬼臼毒素類成分，最后以少量乙醇溶液解吸附，獲得較高含有量的鬼臼毒素提取物。該方法避免了大量使用有機溶劑，而且簡便、快速、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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中圖分類號：R284.2

文獻標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0212-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.051

*通信作者：李茂星（1973—），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥新藥研究與開發(fā)。Te1：（0931）8994676，E-mai1：1imaox2005@a1iyun.com

作者簡介：王謹慧（1977—），女，副主任中藥師，研究方向為中藥炮制與制劑工程。Te1：13919917221

收稿日期：2014-11-03